研究背景卵巢癌病理类型繁杂,绝大多数是上皮性癌,包含浆液性癌、粘液性癌以及子宫内膜样癌主要三种亚型,其中占最多的类型是浆液性卵巢癌,早期症状具有隐匿性,极易广泛播散和转移,使得就诊时已属晚期的患者超过70%,五年生存率仅有30%。因为缺乏卵巢恶性肿瘤的早期筛查诊断技术手段,其死亡率居于妇科恶性肿瘤的首位,对世界妇女的健康和生命造成严重威胁。虽然在临床研究和医学科学研究中付出了很多努力,但近五十年来卵巢癌的生存率并没有明显改变。至今尚不清楚卵巢癌的发生、发展机制,因此,通过探索寻找与卵巢癌发生、发展密切相关的基因,从根本上阻断其发生将具有重要的研究与临床意义。近年来在输卵管伞端部位发现了被称之为输卵管浆液原位癌的早期高级别恶性浆液卵巢癌病变,这一发现为研究卵巢癌早期的发生提供了全新的概念和研究材料。目前研究得知,通过调控某些抑癌基因和致癌基因的表达,micro RNA(mi RNA)可以影响细胞的功能,例如增殖、迁移和侵袭等。许多研究发现,在多种肿瘤的发生、发展的过程中,mi RNA均出现了异常表达。在卵巢癌中,mi RNA也发挥着重要的作用。前期我们通过采用mi RNA芯片技术检测了八对浆液性卵巢癌组织和正常输卵管伞端组织,研究结果发现mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p在浆液性卵巢癌组织中具有显著差异性表达。经研究发现在肝癌、胃癌肿瘤的发生、发展过程中mi R-129发挥重要的调控作用,但在浆液性卵巢癌中的作用机制的研究,没有相关报道。本课题将在前期研究基础之上对mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p在浆液性卵巢癌的表达水平、生物功能及作用机制进行初步的探讨。研究目的1.明确在浆液性卵巢癌组织和输卵管伞端组织中mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p的表达水平差异。2.明确mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p对浆液性卵巢癌细胞系Skov3细胞增殖、迁移、侵袭功能的调节作用。3.初步进行mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p在浆液性卵巢癌中的细胞生物学功能机制探讨。研究方法1.首先进行100例手术切除后浆液性卵巢癌患者的肿瘤石蜡组织和50例正常输卵管伞端石蜡组织的筛选和收集,然后再从石蜡标本组织中提取总RNA,反转录,采用q RT-PCR方法检测在癌组织和正常组织中mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p的相对表达量水平,并通过相对定量法分析差异表达。2.运用mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p-mimics化学合成类似物,通过Hi Per Fect reagent瞬时转染的方法,转染人浆液性卵巢癌细胞系Skov3,过表达mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p后,进行细胞划痕、MTT和transwell迁移、侵袭实验,检测其对Skov3卵巢癌细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响作用。3.运用生物信息学分析软件DIANA LAB、Target Scan和Mi Randa预测mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p可能的靶基因,应用DAVID数据库对预测结果进行功能聚类分析,并对其中参与细胞迁移、侵袭能力相关的癌基因进行筛选。用Western-blot方法对其预测的靶基因编码的蛋白进行检测,观察其在mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p上调的卵巢癌细胞Skov3内的表达水平变化。并通过运用双荧光素酶报告基因实验,验证预测的靶基因与mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p之间的关系。实验结果1.mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p在浆液性卵巢癌组织中的表达水平显著低于正常输卵管组织。2.细胞划痕实验和transwell实验显示,运用mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p-mimics通过Hi Per Fect reagent瞬时转染使卵巢癌细胞Skov3内过表达mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p后,肿瘤细胞迁移能力显著减弱。MTT实验提示,过表达mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p后,肿瘤细胞增殖能力显著减弱。Transwell侵袭实验提示,过表达mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p后,卵巢癌细胞的侵袭能力显著减弱。3.生物信息学预测显示BZW1为mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p的可能靶基因之一,q RT-PCR和Western-bolt实验结果显示,在分别过表达mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p的卵巢癌细胞Skov3内,BZW1表达显著降低。双荧光素酶报告基因实验证明了BZW1是mi R-129-1-3p的靶基因,且也可能是mi R-129-2-3p的靶基因。结论1.mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p在卵巢浆液性癌组织中低表达。在体外细胞功能实验中,过表达mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p后对卵巢癌细胞的迁移、增殖、侵袭能力起到明显的抑制作用。通过其对浆液性卵巢癌的增殖、转移和侵袭发挥抑制作用推测其可能是抑癌基因。2.BZW1是mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p潜在的靶基因,mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p可能通过抑制BZW1的表达水平途径,从而起到抑制卵巢癌转移和侵袭的作用。综上所述,本研究初步显示,mi R-129-1-3p/mi R-129-2-3p可能是卵巢癌发生相关的新的潜在抑癌基因,其作用机制可能是通过靶向调节BZW1基因表达水平实现。为进一步明确卵巢肿瘤的发生、发展分子机制,未来的基因治疗和个体化临床诊疗方案提供了全新的指导方向以及初步的理论基础。