【摘 要】
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在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达pET-28a(+)-proPO,SDS-PAGE和Western-blotting分析,均能检测到一条分子量为79.4 kDa的特异性条带,与推导的融合蛋白理论分子量(82.4 kDa)基本
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在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达pET-28a(+)-proPO,SDS-PAGE和Western-blotting分析,均能检测到一条分子量为79.4 kDa的特异性条带,与推导的融合蛋白理论分子量(82.4 kDa)基本相符;包涵体变性后对经Ni-NTA agarose纯化的变性液进行复性,复性液表现出0.3851单位/mg蛋白的PO活性;不同条件下的诱导表达结果显示,18℃时诱导培养能检测到可溶性的目的蛋白表达,经诱导9 h时后可溶性的目的蛋白表达比例达到最高,约占菌体可溶性蛋白总量的5.56%;可溶性表达的目的蛋白经纯化、胰酶消化后,可检测到分子量分别为60 kDa、42.7 kDa的特异性条带,并表现出0.4249单位/mg蛋白的PO活性。将斑节对虾酚氧化酶原(proPO)克隆进昆虫表达载体pIZT/V5-His中,构建目的基因表达载体pIZT/V5-His-proPO。通过脂质体法转染家蚕Bm-N细胞,ZeocinTM筛选,得到稳定表达proPO的家蚕Bm-N转染细胞。经过SDS-PAGE和Western-blotting检测,可检测到一条分子量大约为81.5 kDa大小的特异性条带,证明proPO基因在家蚕Bm-N转染细胞中成功得到表达,但分子量比预计融合蛋白大小(79.4 kDa)稍高,估计是细胞对目的蛋白进行了修饰作用。
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