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目的:探讨内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(visceral adipose tissue-derived serpin,Vaspin)对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的INS-1细胞自噬水平的影响以及Vaspin是否通过影响PA诱导的INS-1细胞自噬从而影响细胞增殖、凋亡及功能,进一步为脂肪细胞因子Vaspin治疗2型糖尿病及其潜在的具体作用机制奠定理论基础。方法:(1)培养INS-1细胞,分为:正常组:用普通培养基培养24h;PA组:以0.5 mmol/L PA和普通培养基培养24h;PA+Vaspin组:先加入320 ng/ml Vaspin和普通培养基预培养2h,再以0.5 mmol/L PA+320 ng/ml Vaspin+普通培养基共培养24h;PA+Vaspin+雷帕霉素(Rapamycin)组:先以50 nmol/L Rapamycin和普通培养基预培养2h,再以0.5 mmol/L PA+320 ng/ml Vaspin+普通培养基共培养24h;PA+Vaspin+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组:先以1mmol/L 3-MA和普通培养基预培养2h,再以0.5 mmol/L PA+320 ng/ml Vaspin+普通培养基共培养24h。(2)葡萄糖(3.3mmol/L和16.7mmol/L)刺激的胰岛素分泌实验(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)测定每组胰岛素分泌水平,明确Vaspin对PA诱导的INS-1细胞分泌功能的影响。(3)Western blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phos-phorylated m TOR,p-m TOR)、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ以及P62等自噬相关蛋白水平,明确Vaspin对PA诱导的INS-1细胞自噬水平的影响。(4)m RFP-GFP-LC3融合蛋白检测自噬流水平,观察Vaspin对PA诱导的INS-1细胞自噬流的影响。(5)采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,研究Vaspin对PA诱导的INS-1细胞增殖的影响。(6)流式细胞仪检测细胞凋亡水平,观察Vaspin对PA诱导的INS-1细胞凋亡的影响。结果:(1)与正常组相比,PA组INS-1细胞上清液中胰岛素分泌水平在3.3mmol/L葡萄糖和16.7mmol/L葡萄糖刺激下均降低(1.02±0.08 vs.0.54±0.06,P=0.000;1.15±0.13vs.0.71±0.05,P=0.000),Vaspin干预组较PA组均升高(0.76±0.03 vs.0.54±0.06,P=0.001;0.91±0.04 vs.0.71±0.05,P=0.011)。(2)与正常组相比,PA组INS-1细胞p-m TOR与m TOR蛋白比值低(2.04±0.14vs.1.19±0.09,P=0.000),Vaspin干预组p-m TOR与m TOR蛋白比值较PA组高(1.51±0.05 vs.1.19±0.09,P=0.005);同时,PA组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与正常组相比明显增加(0.81±0.07 vs.0.65±0.04,P=0.005;2.35±0.25 vs.1.16±0.11,P=0.000;),P62蛋白水平降低(0.60±0.08 vs.1.04±0.19,P=0.000);Vaspin干预组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平较PA组低(0.58±0.04 vs.0.81±0.07,P=0.001;1.95±0.08 vs.2.35±0.25,P=0.007),P62蛋白增加(0.82±0.03 vs.0.60±0.08,P=0.032)。(3)PA组自噬溶酶体数量较正常组多(8.33±1.53 vs.0.33±0.58,P=0.000),Vaspin干预后降低(3.67±1.53 vs.8.33±1.53,P=0.001)。(4)与正常组相比,PA干预INS-1细胞24小时后细胞增殖率降低(1.00±0.00 vs.0.50±0.16,P=0.000),Vaspin组较PA组细胞增殖率增加(0.84±0.76 vs.0.50±0.16,P=0.002)。(5)与正常组相比,PA干预INS-1细胞24小时后细胞凋亡明显增加(7.91±0.50vs.22.15±2.05,P=0.000),Vaspin组较PA组细胞凋亡明显减少(13.23±1.97 vs.22.15±2.05,P=0.000)。结论:(1)PA可诱导INS-1细胞过度自噬和凋亡,抑制细胞增殖,同时使INS-1细胞分泌胰岛素的能力下降。(2)Vaspin干预可抑制PA诱导的INS-1细胞过度自噬和凋亡,促进细胞增殖,改善其分泌功能。