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目的建立一种基于mRNA的大肠杆菌RT-PCR检测方法,检测消毒前后水中大肠杆菌的存活情况,为快速评价饮用水消毒效果提供方法。方法1.选取三种大肠杆菌特异基因——tuf A基因、β-半乳糖苷酶基因和β-葡萄糖醛酸酶基因进行引物设计合成,选用大肠杆菌8099菌种,十倍梯度系列稀释后,提取mRNA进行反转录PCR,不断优化反应体系和反应条件,经40轮基因扩增后,使用2%琼脂糖凝胶电泳观察检测结果。2.参照《消毒技术规范》(2002版)中悬液定量杀菌试验的内容,采用常用水消毒剂——二氯异氰尿酸钠和二氧化氯进行消毒试验,使用传统培养法、普通PCR技术和RT-PCR方法检测消毒前后大肠杆菌活菌、DNA和RNA的存在情况,并分别进行对比分析。3.消毒试验中试验菌悬液采用两种常用水消毒剂低浓度剂量消毒处理后,作用管在4℃环境中放置12h,于5个不同时间点进行反转录PCR试验,观察目的mRNA信号检出随时间变化的情况,定性判断新方法用于水消毒效果评价的时效性。结果1.使用大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶基因设计合成引物,建立基于mRNA的反转录PCR方法用于大肠杆菌活菌的快速检测,检测时间约为6-8h,特异性强,检测灵敏度约为3.6×103cfu/mL。2.大肠杆菌菌悬液经40mg/L二氯异氰尿酸钠溶液处理5min后,培养法显示细菌被完全杀灭；普通PCR方法细菌DNA检测结果强阳性；RT-PCR方法细菌RNA检测结果阴性。经20mg/L二氯异氰尿酸钠溶液处理5min后,培养法显示剩余菌液浓度为4.0×103cfu/mL;普通PCR方法细菌DNA检测结果强阳性,即有高浓度大肠杆菌DNA存在；RT-PCR方法显示弱阳性,即菌液浓度较低。3.大肠杆菌菌悬液经4mg/L二氧化氯溶液处理5min后,培养法显示细菌被完全杀灭；普通PCR方法细菌DNA检测结果强阳性；RT-PCR方法细菌RNA检测结果阴性。经0.8mg/L二氧化氯溶液处理5min后,培养法显示剩余菌液浓度为8.9×103cfu/mL;普通PCR方法显示强阳性,即有高浓度大肠杆菌DNA存在；RT-PCR方法显示弱阳性,即菌液浓度较低。4.经20mg/L二氯异氰尿酸钠溶液、0.8mg/L二氧化氯溶液处理的大肠杆菌菌悬液,置于4℃环境中,12h内,培养法检测大肠杆菌菌液浓度未发生明显改变,RT-PCR方法检测结果显示弱阳性,且条带亮度基本保持不变。结论1.在实验室条件下,新建立的反转录PCR方法可以快速、特异的检出大肠杆菌活菌,最低检出限为3.6×103cfu/mL。2.在实验室条件下,进行二氯异氰尿酸钠和二氧化氯水消毒效果鉴定评价的实验室阶段,当大肠杆菌活菌数在新方法最低检出限之上时,新建立的RT-PCR方法可以定性的检测消毒效果,与培养法一致。3.4℃条件下,在低浓度二氯异氰尿酸钠或二氧化氯作用后的环境中,大肠杆菌死菌mRNA分子迅速降解；RT-PCR方法对于两种消毒剂消毒后活菌的检测是准确的,可以去除死菌的干扰。