一、背景和目的脑胶质瘤约占颅内肿瘤的46%,脑肿瘤中胶质细胞瘤发病率最高,也是最具侵袭性、致死性的恶性肿瘤之一。随着近年来肿瘤干细胞研究的深入,许多学者证明了脑胶质瘤干细胞的存在。脑胶质瘤干细胞是脑胶质瘤中的很小一部分细胞,具有引起肿瘤发生、维持肿瘤生长、保持肿瘤异质性的能力。肿瘤干细胞可分化成为新的肿瘤细胞,并且对治疗更具抵抗性,因而被视为是肿瘤发生、复发、转移的根源。如果传统治疗忽略了这部分细胞,即使其他大部分肿瘤细胞都被消灭,肿瘤仍然会面临着复发的可能。因此,杀灭肿瘤干细胞将是决定肿瘤长期疗效的重要环节,遗憾的是,迄今为止,所有的放疗及化疗方法均无法杀灭肿瘤干细胞。肿瘤的发生是一个复杂的过程,既有癌基因的异常激活,又有抑癌基因的失活。PTEN基因是继P53抑癌基因之后发现的另一个较为广泛的参与肿瘤瘤发生发展的抑癌基因之一。PTEN基因参与肿瘤干细胞信号通路的调控,其可能通过作用于PI3K-AKT信号通路或者m TOR信号通路,从而促进胶质瘤干细胞的增殖、自我更新、侵袭等恶性肿瘤的性质。有文献表明PTEN基因在胶质瘤干细胞的发生发展中存在重要的作用,但是其对胶质瘤干细胞具体的影响及机制未见报道。因此,我们推测PTEN基因可能具有通过作用于胶质瘤干细胞,抑制了胶质瘤干细胞的干性特征,从而抑制神经胶质瘤的发生发展。在本研究中,我们不仅探讨胶质瘤干细胞的干性特征及PTEN在胶质瘤组织及胶质瘤干细胞中的表达,我们还通过PTEN慢病毒的构建,探讨PTEN基因对胶质瘤干细胞U87S的干性特征、侵袭、凋亡能力的影响。二、材料和方法1、胶质瘤干细胞U87S的培养及检测胶质瘤干细胞干性相关的特性。2、免疫组化、定量PCR法、Western blot法检测PTEN基因及蛋白在胶质瘤组织中及正常脑组织中的表达。3、PTEN基因慢病毒的构建、转染胶质瘤干细胞U87S及转染效率的测定。4、免疫荧光、二次成球、定量PCR法检测PTEN基因对胶质瘤干细胞U87S干性特征的影响。5、Transwell实验、Western blot法检测PTEN基因对胶质瘤干细胞U87S侵袭能力的影响及流式细胞术检测PTEN基因对胶质瘤干细胞早期凋亡的影响。6、应用SPSS 17.0软件进行数据分析,凋亡和侵袭实验的结果采用单因素方差分析。检验水准为α=0.05三、结果1、胶质瘤干细胞U87S的培养与鉴定为了研究胶质瘤干细胞,我们采用逆转培养法从胶质瘤细胞株U87中获得呈悬浮球生长的胶质瘤干细胞。通过免疫荧光技术检测胶质瘤干细胞U87S的干细胞表面标记物CD133/A2B5、Nestein、ALDH1、PLAGL2的表达,我们发现我们培养的胶质瘤干细胞不仅高表达干细胞标记物,还具有多向分化能力、自我更新能力。以上数据表明,我们培养的胶质瘤干细胞满足干细胞的特性,满足下一步实验的要求。2、PTEN基因及蛋白的表达我们采用免疫组化、定量PCR法、Western blot法检测PTEN基因及蛋白在胶质瘤组织中及正常脑组织中的表达。我们发现PTEN基因在胶质瘤组织及胶质瘤干细胞U87S中的表达明显低于正常脑组织。为我们下一步的实验奠定实验基础。3、PTEN基因对胶质瘤干细胞U87S干性特征的影响。我们采用免疫荧光、二次成球、定量PCR法检测PTEN基因对胶质瘤干细胞U87S干性特征的影响。我们发现转染PTEN基因后胶质瘤干细胞标记物(CD133、A2B5、Nestein、SOX2、ALDH1、PLAGL2)的表达明显降低,自我更新速率明显较低。PTEN基因可能通过抑制胶质瘤干细胞的特性,从而抑制胶质瘤的发生发展。4、PTEN基因对胶质瘤干细胞U87S侵袭、凋亡能力的影响我们采用Transwell实验、Western blot法检测PTEN基因对胶质瘤干细胞U87S侵袭能力的影响及流式细胞术检测PTEN基因对胶质瘤干细胞早期凋亡的影响。我们发现PTEN基因不仅可以抑制胶质瘤干细胞的侵袭能力及降低侵袭蛋白MMP2、MMP9的表达,还能诱导胶质瘤干细胞的早期凋亡。四、结论在本研究中,我们证明了PTEN作为抑癌基因,通过抑制胶质瘤干细胞的干性特征、侵袭能力,促进胶质瘤干细胞的凋亡,从而抑制了胶质瘤的进展。为PTEN基因作为人脑胶质瘤干细胞治疗的分子靶标提供理论依据。