论文部分内容阅读
细胞周期后期促进复合体(Anaphase-PromotingComplexC,APC/C)是由多个亚基组成的大小为1.5MD的E3泛素连接酶。APC15是细胞周期后期促进复合物的一个亚基,在有丝分裂中定位在APC与有丝分裂检查点复合体(mitoticcheckpointcomplex,MCC)连接位点附近,当所有丝分裂中姐妹染色单体上的动粒与两极微管均连接正确时,MCC完全分解,APC/CCDC20激活促进细胞周期从中期向后期的转化。已有研究表明降低APC15在体细胞中的表达会降低细胞通过有丝分裂中期检验点的速度,但是在减数分裂中关于APC15的作用仍没有明确报道。 为了研究APC15在卵母细胞减数分裂中的作用,我们首先研究了其在卵母细胞减数分裂中的定位。我们将小鼠卵母细胞体外分别培养2小时、8小时、9.5小时、12小时分别对应GVBD期、MⅠ期、AⅠ-TⅠ期以及MⅡ期。使用激光共聚焦显微镜检测在减数分裂中后期APC15在卵母细胞中的亚细胞定位及染色体和纺锤体的形态。在GVBD后,APC15开始出现在染色体着丝粒上并一直定位在着丝粒上直到MⅡ期。 之后为了研究APC15在减数分裂中的作用,我们通过注射APC15特异性SiRNA敲降APC15的表达量。GV期的卵母细胞在注射SiRNA后再用含有2.5μM米力农的M2培养液中培养24小时后转移到新鲜的M2培养液中继续体外培养。通过检测第一极体的排放率及排放时间确定卵母细胞减数分裂受到的影响。经过统计,卵母细胞的GVBD比例略微降低,第一极体的排放率显著降低并且随着培养时间的延长,第一极体的排放情况不再发生改变。 接下来我们将注射SiRNA敲降APC15后没有排出第一极体的卵母细胞收集起来通过免疫荧光方法检测这些卵母细胞所处的减数分裂时期。经检测绝大部分卵母细胞被阻滞在第一次减数分裂中期,注射SiRNA敲降APC15的卵母细胞的纺锤体检验点蛋白BUB3的免疫荧光强度高于对照组的BUB3的免疫荧光强度。 本实验首次在减数分裂过程中发现APC15蛋白的定位和功能,证明了APC15在减数分裂纺锤体检验点中发挥必不可少的功能,它的缺失会导致卵母细胞第一极体不能正常排出,减数分裂进程被阻滞在第一次减数分裂中期。以上现象均说明在APC15缺失的情况下,小鼠卵母细胞不能正常成熟,进而影响到之后的受精及胚胎发育过程。该研究也为哺乳动物不孕不育症的研究及治疗提供了一定的理论基础。