论文部分内容阅读
背景:特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是以肺泡周围弥漫性炎症、上皮细胞损伤、成纤维细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积导致的肺组织不可逆性损坏的慢性间质性肺疾病。炎性促纤维化因子转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可以诱导肺成纤维细胞活化,同时可以抑制成纤维细胞自噬,而成纤维细胞的自噬不足是导致肺纤维化形成的重要原因之一。TGF-β1通过激活下游PI3K/AKT/m TOR通路抑制自噬,促进了肺纤维化的形成。异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)是从甘草的根中提取的一种天然黄酮类化合物单体,具有抗肿瘤、抗炎及抗氧化等多种作用。同时,ISL作为一种天然的自噬诱导剂,在治疗肿瘤等多种疾病过程中,可以通过抑制PI3K/AKT/m TOR通路激活自噬发挥作用。既往有研究发现ISL可以减轻脂肪组织和肾组织纤维化,在抗肾纤维化中主要通过抑制TGF-β1信号通路减轻肾组织中系膜基质的沉积,然而其对肺纤维化的作用及机制尚未见报道。目的:本研究旨在探讨异甘草素对TGF-β1诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞)活化的作用,并对具体的分子机制进行研究,为肺纤维化的治疗寻找新的可能药物并提供理论依据。方法:以TGF-β1诱导MRC-5肺成纤维细胞建立体外纤维化形成的模型,通过MTT法和划痕实验检测ISL对TGF-β1诱导MRC-5细胞增殖和迁移能力的影响,q PCR、Western blot及免疫荧光检测MRC-5细胞分化及ECM产生相关标志的表达;通过Western blot、免疫荧光及瞬时转染GFP-LC3质粒到MRC-5细胞中,检测ISL对TGF-β1处理MRC-5细胞自噬水平的影响;联用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和激活剂雷帕霉素(Rapmycin,Rap)检测ISL调节的自噬在TGF-β1诱导MRC-5细胞活化中的作用;Western blot检测通路相关蛋白的变化,及使用PI3K/AKT通路的抑制剂LY294002和激活剂胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)检测ISL调节的自噬在TGF-β1诱导MRC-5肺成纤维细胞活化中的具体分子机制。结果:MTT法表明ISL以浓度依赖性的方式抑制了TGF-β1诱导MRC-5细胞的增殖;通过划痕实验证明了ISL抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞的迁移;q PCR、Western blot及免疫荧光结果显示ISL明显下调了TGF-β1诱导的MRC-5细胞中α-平滑肌激动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、纤连蛋白(fibronectin,FN)以及Ⅰ型胶原α1(collagen type I alpha 1,COLIA1)的m RNA和蛋白表达;Western blot、免疫荧光及瞬转GFP-LC3质粒等实验发现ISL上调了自噬相关蛋白的表达并抑制了PI3K/AKT/m TOR通路。此外,Western blot检测发现Rap进一步增加了ISL减轻细胞分化和ECM沉积的作用,3-MA减弱了ISL减轻细胞分化和ECM沉积的作用;加入LY294002和IGF-1后,Western blot结果证明ISL通过抑制PI3K/AKT/m TOR通路激活自噬,从而抑制TGF-β1诱导MRC-5肺成纤维细胞的活化。结论:ISL可以抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞的增殖和迁移,并通过激活自噬减轻TGF-β1诱导MRC-5细胞分化以及ECM沉积,表明ISL可以抑制TGF-β1诱导MRC-5肺成纤维细胞的活化;ISL抑制TGF-β1诱导肺成纤维细胞活化的具体分子机制是通过抑制PI3K/AKT/m TOR通路激活自噬介导的。