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γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质,脑中的GABA主要通过作用于神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)神经元、刺鼠基因相关蛋白(Agouti gene-related protein,AgRP)神经元和前阿黑皮素原(Pro-opiomelanocortin,POMC)神经元等促进食欲。由于外源性 GABA 在血液中不能通过血脑屏障,因此主要通过调节相关食欲激素来调节食欲。前人研究发现,肠道壁上的迷走神经也参与了食欲调节,外源物质可通过肠道壁上的迷走神经,激活脑干孤束核和下丘脑弓状核调节食欲。而外源性GABA是否通过外周迷走神经调节食欲以及相关的作用机制还未见报道。因此本文试验通过免疫组织化学和荧光定量PCR等方法,对外源性GABA能否通过外周迷走神经来调节食欲以及作用的相关机制进行了研究。本试验拟研究GABA与GABAA受体(GABAA receptor,GABARA)结合对食欲产生的影响,并选择Bicuculline作为GABARA的抑制剂。利用免疫组织化学和荧光定量PCR法研究空肠上GABARA、GABA转氨酶2(GABA-transaminase,GAT)、胰高血糖素样肽 1(Glucagon-likepeptide-1,GLP-1)、synapsin-1 以及下丘脑弓状核 NPY、POMC和孤束核、迷走神经背核c-fos 阳性细胞的表达水平。利用免疫荧光双标法检测GABARA与GLP-1共定位表达情况。通过迷走神经干切断试验,研究迷走神经在GABA对下丘脑弓状核NPY、POMC和脑干c-fos 阳性细胞表达水平的影响。研究结果如下:1、为了先择合适的GABA的灌胃剂量,试验设立Control组、10mg/kg GABA组、30mg/kg GABA组和50mg/kg GABA组,灌胃5周。研究发现,灌胃30mg/kg剂量的GABA小鼠在摄食量及体重上显著高于Control组、10mg/kg GABA和50mg/kg GABA(p<0.05)。10mg/kg GABA 与 Control 组相比无差异(p>0.05)。50mg/kg GABA 在灌胃初期与Control组相比显著提高了小鼠摄食量及体重(p<0.05),但在灌胃后期发现小鼠精神抑郁,摄食量及体重下降,与Control组相比无差异(p>0.05)。因此后续试验选择30mg/kg GABA为灌胃剂量。2、为了研究GABA对小鼠食欲及体重的影响,本试验设立Control组、GABA组、GABA+Bicuculline 组,灌胃 6 周。Bicuculline 是 GABARA的抑制剂,GABA+Bicuculline组在第4周灌胃GABA的同时腹腔注射4mg/kg Bicuculline。研究发现,GABA组小鼠的摄食量和体重与Control组相比显著增加(p<0.05)。在灌胃前3周,GABA+Bicuculline组的摄食量与Control组相比显著增加(p<0.05),与GABA组相比无差异(p>0.05)。但注射抑制剂Bicuculline后,Bicuculline+GABA组小鼠的摄食量与GABA组相比显著下降(p<0.05)。3、为了研究GABA对肠道GABARA、GAT2、GLP-1、synapsin-1表达的调节,利用免疫组化和荧光定量PCR研究发现,GABA组小鼠空肠上GABARA、GAT2、和synapsin-1阳性细胞表达量与Control组相比显著上升(p<0.05),而GLP-1阳性细胞表达量显著下降(p<0.05)。在注射Bicuculline后发现,GABA+Bicuculline组与GABA组相比小鼠空肠上GABARA、GAT2、和synapsin-1阳性细胞表达量显著下降(p<0.05),而GLP-1阳性细胞表达量则显著上升(p<0.05)。免疫荧光双标法发现,GABARA和GLP-1有共定位表达,表达GABARA的肠道内分泌细胞上同时表达GLP-1。4、为了研究GABA对下丘脑弓状核NPY、POMC和脑干孤束核、迷走神经背核c-fos表达的影响,利用免疫组化和荧光定量PCR研究发现,GABA组小鼠下丘脑弓状核NPY和孤束核、迷走神经背核c-fos的阳性细胞的表达量与Control组相比显著上升(p<0.05),而下丘脑弓状核POMC 阳性细胞表达量显著下降(p<0.05)。但在注射Bicuculline后发现,GABA+Bicuculline组与GABA组相比小鼠下丘脑弓状核NPY和孤束核、迷走神经背核c-fos的阳性细胞的表达量显著下降(p<0.05),而下丘脑弓状核POMC 阳性细胞表达量显著上升(p<0.05)。5、为了研究迷走神经对GABA调节小鼠食欲及体重的影响,本试验设立Control组、假手术组、假手术+GABA组、迷走神经切断+GABA组,灌胃6周。通过切断迷走神经干灌胃GABA后发现,与假手术组相比,假手术+GABA组小鼠的摄食量和体重均显著上升(p<0.05),而迷走神经切断+GABA组小鼠的摄食量和体重与假手术+GABA组相比均显著下降(p<0.05)。6、为了研究迷走神经在GABA调节下丘脑弓状核NPY、POMC和脑干孤束核、迷走神经背核c-fos表达中的作用,切断迷走神经干灌胃GABA后发现,小鼠下丘脑弓状核NPY和孤束核、迷走神经背核c-fos的阳性细胞表达量较假手术+GABA组相比显著下降(p<0.05),而下丘脑弓状核POMC 阳性细胞表达量显著上升(p<0.05)。而假手术+GABA组与假手术组相比,小鼠下丘脑弓状核NPY和孤束核、迷走神经背核c-fos的阳性细胞表达量显著上升(p<0.05),下丘脑弓状核POMC 阳性细胞表达量显著下降(p<0.05)。综上所述,在肠道中,外源性GABA可能被GAT2转运至肠壁内分泌细胞,与GABARA结合后抑制肠内分泌细胞分泌GLP-1,并促进肠道synapsin-1的表达,由此进一步通过迷走神经激活脑干孤束核和迷走神经背核,孤束核和迷走神经背核通过投射纤维促进下丘脑弓状核NPY,抑制POMC表达,从而提高了食欲。这为外源性GABA调节食欲提供了新的机制,同时也对进一步认识和理解脑肠轴在食欲调节中的作用具有重要意义。