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研究背景增生性瘢痕是以细胞外基质过度沉积为特点的疾病,目前临床上尚缺乏有效的防治方法,其本质是胶原形成与分解代谢间的速率不平衡。作为损伤修复的先行者,巨噬细胞介导的免疫微环境的改变是组织愈合与再生过程的研究重点。大量研究证实,巨噬细胞长期异常的极化状态是导致增生性瘢痕形成的重要因素。在此状态下,巨噬细胞表达大量促纤因子,引发级联反应,最终导致皮肤组织的纤维化。集落刺激因子-1 受体（colony stimulation factor-1 receptor,CSF1R）是表达于巨噬细胞表面的受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases,RTKs）。CSF1R与其配体集落刺激因子-1（colony stimulation factor-1,CSF1）特异性结合引发的一系列信号改变已被证实是调节巨噬细胞生长、增殖和分化的重要途径。CSF1/CSF1R信号通路在增生性瘢痕形成中的作用尚未见报导。鉴于该信号通路在调节巨噬细胞表型转化时展现出高效的抗炎功能,以及M2巨噬细胞在增生性瘢痕形成中长期存在异常活化的现象,因此我们拟以CSF1R为着力点,通过特异性靶向抑制CSF1R,调节巨噬细胞的极化状态,促进瘢痕组织的重塑进程,以期实现理想的抗瘢痕效应。研究目的1.明确CSF1R是否是影响增生性瘢痕形成的关键因素。2.明确CSF1R抑制剂是如何调控巨噬细胞,进而发挥抗瘢痕形成的作用。研究方法1.CSF1R在增生性瘢痕组织中的表达特性（1）利用qPCR和ELISA技术,检测CSF1R在成人增生性瘢痕和正常皮肤中的表达差异。（2）利用免疫染色技术检测M2巨噬细胞在成人增生性瘢痕和正常皮肤中的数量分布差异。（3）构建皮肤损伤修复的动物模型,于损伤后多节点取材,qPCR检测Csf1r在此修复过程中的动态变化。2.体内抑制CSF1R信号对增生性瘢痕形成的影响（1）构建鼠尾和兔耳的增生性瘢痕模型,并进行实验分组。（2）待鼠尾和兔耳伤口上皮化完成后,实验组（GW2580组）体内应用CSF1R的靶向抑制剂GW2580。（3）两种动物模型均于术后一月取材。以温哥华瘢痕评定量表（Vancouver scar scale,VSS）评估瘢痕的形态,HE、马松三色染色观察瘢痕的组织学形态,免疫荧光和免疫组织化学技术检测瘢痕组织中CSF1R以及纤维化标志物的表达,qPCR检测纤维化相关基因的表达。3.体外抑制CSF1R信号对增生性瘢痕成纤维细胞生物学特性的影响（1）明确不同刺激物对Raw 264.7细胞极化状态的影响:分别以CSF1、CSF1+GW2580、CSF1+GDC0068 刺激 Raw 264.7 细胞,qPCR 检测巨噬细胞极化相关基因的变化,流式细胞技术检测M1、M2巨噬细胞表面标志物CD86、CD206的表达。（2）明确不同极化状态的巨噬细胞对增生性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移能力的影响:通过细胞共培养技术,将经受不同刺激的巨噬细胞与增生性瘢痕成纤维细胞共培养,CCK-8法检测增生性瘢痕成纤维细胞的增殖情况,划线法观察瘢痕成纤维细胞迁移能力的改变。研究结果1.CSF1R在增生性瘢痕组织中的表达特性（1）成人增生性瘢痕组织中CSF1R的RNA和蛋白的表达量均明显高于成人正常皮肤。（2）免疫荧光染色显示成人增生性瘢痕中M2巨噬细胞的特定标志物CD206的密度较成人正常皮肤高。（3）在小鼠皮肤损伤愈合过程中,Csf1r的表达量随时间逐渐升高,于术后16天达到顶峰,至术后30天,仍处于高水平的表达状态。2.体内抑制CSF1R信号对增生性瘢痕形成的影响（1）鼠尾增生性瘢痕模型:术后一月,Control组的瘢痕外观更明显:瘢痕充血呈红色,高出皮面,触之偏硬,与周围皮肤差异明显;而GW2580组术区色泽与周围皮肤相似,局部皮肤柔软,不高出周围皮肤表面。抑制CSF1R后,鼠尾增生性瘢痕的VSS评分明显下降。兔耳增生性瘢痕模型:抑制CSF1R后,兔耳增生性瘢痕的评分明显下降,差异有统计学意义。（2）鼠尾增生性瘢痕模型:HE染色可见Control组的瘢痕内部胶原纤维较厚,交叉重叠,排列紊乱。胶原纤维间见大量成纤维细胞增生、浸润。GW2580组胶原纤维较薄,排列整齐,其间有少量成纤维细胞浸润。GW2580组瘢痕指数较Control组降低。马松三色染色可见Control组的瘢痕内部大量蓝染的胶原纤维,结构粗大、紊乱。而GW2580组瘢痕内部胶原纤维纤细,排列整齐,胶原含量较Control组明显降低。兔耳增生性瘢痕模型:HE染色可见Control组的瘢痕内部胶原纤维较厚,排列紊乱。而GW2580组瘢痕内部胶原纤维较薄,排列整齐。马松三色染色可见Control组的瘢痕内部大量蓝染的胶原纤维,结构粗大、紊乱,而GW2580组瘢痕内部胶原纤维纤细,排列整齐,胶原含量明显低于Control组,差异有统计学意义。（3）鼠尾瘢痕组织中,GW2580组Col1a1、Ctgf.Tgfβ1、Acta2等纤维化相关基因的表达量明显低于Control组。兔耳瘢痕组织中,GW2580组Colla1、Fn1、Tnc等纤维化相关基因的表达量明显低于Control组。（4）免疫荧光结果显示:鼠尾瘢痕组织中,Control组TGF-β、α-SMA、CD206表达量高于GW2580组。兔耳瘢痕组织中,Control组瘢痕中Collagen 1、α-SMA表达量高于GW2580组。（5）免疫组织化学结果显示:鼠尾瘢痕组织中,Control组瘢痕中CSF1R和TGF-β信号下游的转录因子Smad2的表达量均高于GW2580组。3.体外抑制CSF1R信号对增生性瘢痕成纤维细胞生物学特性的影响（1）Raw 264.7细胞经由CSF1刺激后,M2标志基因Cd206表达明显上调,M1标志基因Cd86下降;CSF1+GW2580组,Cd206的变化不明显,且Cd86未见明显变化;在CSF1+GDC0068组,Cd206的变化不明显,Ml标志基因Cd86也未见明显变化。（2）Raw 264.7细胞经由CSF1刺激后,CD86阳性率88.9%;CD206阳性率 99.9%;CSF1+GW2580 组,CD86 阳性率 100%,CD206 阳性率 88.2%。CSF1+GDC0068 组,CD86 阳性率 99.5%,CD206 阳性率 89.0%。（3）在巨噬细胞和增生性瘢痕成纤维细胞共培养实验中,自12 h始,CSF1组的成纤维细胞增殖速度开始增加,至48 h增殖速度达到顶峰,之后逐渐放缓。自24h后,相较于Control组（正常培养基培养的增生性瘢痕成纤维细胞）,CSF1组增殖速度明显较快（P<0.05）。而CSF1+GW2580组、CSF1+GDC0068组生长曲线与Control组相近。所有细胞于60 h后增殖活性降低。12 h时CSF1组增生性瘢痕成纤维细胞迁移速度明显较其他三组快,至24 h时,CSF1组已完成迁移。与Control组相比,CSF1+GW2580组、CSF1+GDC0068组的增生性瘢痕成纤维细胞的迁移速度差异不明显。研究结论1.与正常皮肤相比,CSF1R和CD206在成人增生性瘢痕组织中表达升高,提示CSF1R可能是影响增生性瘢痕形成的重要因素;在小鼠皮肤的损伤愈合过程中,Csf1r的表达随时间逐渐升高,且在后期仍维持于相对高水平状态,提示CSF1R参与调节皮肤组织的损伤愈合过程,尤其在组织重塑期发挥作用;2.在鼠尾和兔耳增生性瘢痕模型中抑制CSF1R信号,可显著降低M2巨噬细胞的数量水平和纤维化相关基因的表达,促进瘢痕组织重塑,进而减轻瘢痕的形成;3.巨噬细胞向M2型表型极化受CSF1/CSF1R信号调控。抑制CSF1R信号,M2巨噬细胞促进增生性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移的能力将同时被抑制,这一现象可能与Akt通路被阻断有关。