猪是人类最早驯化的动物之一,中国人驯养家猪的历史可以追溯到新石器时代。而近年来,与猪相关的研究课题一直是研究热点。一方面,猪是畜牧经济的重要物种,猪的抗病研究与人民的生产生活息息相关；另一方面,猪的生理构造与人类更接近,以猪作为模拟人类疾病模型的模式动物能帮助科学家攻克诸多疾病。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)又称蓝耳病病毒,具有超强传染性。高致病性蓝耳病会导致母猪繁殖功能障碍和仔猪死亡,对养猪业造成了巨大的经济损失。科学家们采用各种手段致力于攻克蓝耳病,但尚未取得决定性的进展。本研究中,我们试图通过转基因的方法培育自身能够抗蓝耳病的新品系猪种。过去研究发现,HDAC6是一种特殊的组蛋白去乙酰化酶,除了调控组蛋白的乙酰化水平外,其对胞质中微管蛋白的乙酰化水平同样具有调节作用。HDAC6蛋白定位在细胞质中,对细胞迁移、免疫突触形成、病毒入侵时对细胞的调节具有重要作用。因此,我们推测过表达HDAC6基因会增强动物对病毒入侵的抵抗作用。在本研究中,我们通过转基因克隆的手段,制备了过表达HDAC6转基因的猪,并通过体外细胞攻毒试验和体内攻毒试验证明了其抗病功能。首先我们构建了表达猪jHDAC’6基因的载体,通过细胞转染的方式将载体转染到猪胎儿成纤维细胞内。通过单克隆细胞筛选以及体细胞核移植的手段,得到25头F0代的过表达HDAC6转基因克隆母猪。我们选择Fo代的部分阳性克隆母猪传代配种,得到80头F1代HDAC6转基因猪。接下来通过分子检测确定了阳性率和表达量,证明了HDAC6基因过表达,实现了种系传递。我们选取PRRSA/攻毒中常用的PRRSV CH1a毒株,利用F1代猪制备的转基因阳性猪和阴性猪的肺泡巨噬细胞(PAMs),设计了24 hpi,48hpi,72 hpi三个时间点进行攻毒实验,发现攻毒后转基因阳性PAMs组的带毒量显著低于阴性PAMs组,证明了细胞水平上过表达HDAC6对PRRSV的抵抗作用。根据细胞实验的结果,我们选择4-6周的F1代仔猪共42头进行活体PRRSV攻毒试验和同居感染实验。毒株选取了在我国流行的高致病性毒株PRRSV NVDC JXAl,攻毒剂量为100 TCIDso。通过严格的个体攻毒和同居实验,我们证明了HDACt过表达转基因猪在蓝耳病病毒入侵时,能够阻碍病毒复制,延缓发病时间,减弱发病症状。实验证明过表达HDAC6转基因猪在体外攻毒实验和体内攻毒实验中均表现出对蓝耳病病毒的抗性。过去研究表明,Leptin基因(obese基因,ob)在血糖和脂肪代谢通路中起到重要调控作用。Leptin通过影响下丘脑的激素分泌,从而对食物摄入,能量消耗以及糖代谢和脂代谢起到调控作用。obese基因自然突变小鼠(ob/ob、鼠)模型由于其肥胖及相关并发症被广泛用于医学实验及药物筛选。然而Leptin突变小鼠模型在糖尿病药物临床试验中,未能反映治疗药物诱发心脏病的副作用。所以我们需要与人类生理结构更为接近的模式动物。小型猪与人类的脂肪积累方式和药物敏感度更接近。因此为了建立更适合人类肥胖症的疾病模型,本研究以小型猪为模式动物进行Leptin基因敲除。我们利用基因定点修饰的新技术锌指核酸酶敲除技术实现了Leptin基因定点突变,筛选到了11个阳性突变克隆,突变率达到了8.3%。通过体细胞移植,共获得克隆猪18头,存活11头,经过PCR测序验证,2头为双敲个体,有7头单敲个体,2头阴性个体。并且通过传代配种,获得了72头F1代Leptin基因敲除猪,其中包括35头单敲个体,37头阴性个体。通过该方法可在一年时间内获得含有两个等位基因同时发生敲除的克隆猪,极大的缩短了实验周期。Leptin双敲猪相比野生型猪表现出体型肥胖、高体脂含量、高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等特性,符合肥胖疾病模型应有的病理特征。接下来我们将利用此疾病模型,展开更多的病理学和生理学研究。综上所述,我们通过转基因的方法建立了HDAC6过表达转基因猪,证明过表达猪的HDAC6基因对于蓝耳病病毒的入侵和复制有抵抗作用,为预防和治疗蓝耳病提供了新的思路和途径。同时我们还首次利用锌指核酸酶技术构建了Leptin敲除的肥胖疾病模型猪,为研究人类肥胖引发的相关疾病提供了新的途径。