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背景:肝癌是全球第六大最常被诊断的癌症和第三大癌症死因,在全球发病率中排名第五。肿瘤转移是影响肝癌患者治疗和生存最主要的原因,因此研究肝癌转移的机制具有重要意义。mi RNA是18-24个核苷酸长度的单链非编码RNA,mi R-330-3p位于19Q12.32,并在多种肿瘤中异常表达,与肿瘤的发生、发展、转移有关。EREG为表皮生长因子家族成员,在肾癌、血癌、胃癌、乳腺癌中差异表达显著,与肿瘤细胞生长、转移和预后有关。lnc RNA为大于200个核苷酸长度的长链非编码RNA,且不能编码蛋白,但它们可以在转录、转录后以及翻译等水平上调节基因的表达。Lnc RNA021545位于11号染色体上,长度为3149 bp的长链非编码RNA。本组前期发现lnc RNA021545、EREG和mi R-330-3p差异表达显著,mi R-330-3p对EREG和lnc RNA021545可能存在潜在的靶点。lnc RNA021545可能竞争结合mi R-330-3p,阻止其与EREG结合而调控其水平变化进而调控肝癌转移。但lnc RNA021545-mi R-330-3p-EREG在肝癌中具体的作用机制尚不了解,本论文主要研究lnc RNA021545-mi R-330-3p-EREG对肝癌细胞恶性行为的影响及其作用机制。目的:1.探究EREG、mi R-330-3p、lnc RNA021545在肝癌样本中的表达水平;2.探究mi R-330-3p表达水平变化对EREG和lnc RNA021545表达的影响;3.探究lnc RNA021545表达下调对EREG和mi R-330-3p表达的影响4.明确mi R-330-3p、EREG、lnc RNA021545对HCCLM3和Hu H7细胞体外增殖、迁移、侵袭的细胞行为的影响;5.探究lnc RNA021545-mi R-330-3p-EREG调节HCCLM3和Hu H7细胞恶性行为的作用机制。方法:1.q RT-PCR检测mi R-330-3p、lnc RNA021545,Western blotting（WB）检测EREG在肝癌患者临床样本中的表达情况,并分析三者的相关性及进展研究;2.瞬时转染mi R-330-3p mimic及NC、mi R-330-3p inhibotor及NC,q RT-PCR和WB检测mi R-330-3p对EREG、lnc RNA021545表达水平变化的影响;3.瞬时转染lnc RNA021545小干扰及其NC,q RT-PCR和WB检测lnc RNA021545对EREG、mi R-330-3p表达水平变化的影响;4.双萤光素酶报告实验验证mi R-330-3p对EREG-3′-UTR、lnc RNA021545的靶向结合;5.首先扩增EREG的CDS区序列,构建p CDH-CMV-MCS-EF1-puro-EREG过表达载体;然后将p CDH-CMV-MCS-EF1-puro-EREG及p CDH-CMV-MCS-EF1-puro转染到293T细胞中,分别在24 h、48 h收集病毒液,过滤后储存于-80℃;通过药物筛选感染过的HCCLM3细胞,获得EREG稳定上调和对照组的HCCLM3细胞株,并通过q RT-PCR和WB法检测EREG的表达水平变化;6.MTT法检测mi R-330-3p、EREG和lnc RNA021545对HCCLM3和Hu H7细胞增殖能力的影响;7.Transwell法检测mi R-330-3p、EREG和lnc RNA021545对HCCLM3和Hu H7细胞迁移侵袭能力的影响;8.WB法检测mi R-330-3p、EREG、lnc RNA021545对HCCLM3和Hu H7细胞EMT通路分子表达变化的影响;9.补救实验验证EREG上调是否反转mi R-330-3p对EREG表达、HCCLM3和Hu H7细胞迁移侵袭以及EMT通路分子的影响;10.裸鼠腹股沟注射法检测mi R-330-3p上、下调对HCCLM3细胞体内成瘤性影响,免疫组化法检测EREG、snail、slug、E-cadherin、N-cadherin和vimentin在原位实体瘤中的表达;检测mi R-330-3p上、下调对HCCLM3细胞体内成瘤以及转移潜能的影响;结果:1.与癌旁正常组织相比,在肝癌样本中mi R-330-3p总体表达水平上升70.8%（P=0.0359）,EREG总体表达水平降低32.7%（P=0.0029）,lnc RNA021545总体表达水平降低68.7%（P＜0.0001）;在肝癌患者临床肿瘤组织样本中,EREG与lnc RNA021545表达趋势一致,二者呈正相关（R~2=0.4542,P=0.002）,mi R-330-3p与EREG表达趋势相反呈负相关（R~2=0.2227,P=0.0199）;同时mi R-330-3p与lnc RNA021545表达趋势相反呈负相关（R~2=0.3489,P=0.0024）。2.双萤光素酶报告实验检测发现:与mi R-NC相比,mi R-330-3p mimic与pmir Gl O-EREG-3’-UTR-wt共转染后使萤光素酶活性下降了29.9%（P=0.0142）,当靶位点突变为GCUUUG后,萤光素酶活性无明显变化;同时,mi R-NC相比,mi R-330-3p与pmir Gl O-lnc RNA021545-wt共转染后使萤光素酶相对活性下降了58.9%（P=0.0004）,当靶位点突变为UGCUUUG后,对萤光素酶活性没有抑制作用;3.在HCCLM3细胞中,mi R-330-3p上调使EREG m RNA表达降低了53.5%（P=0.0083）,蛋白水平表达降低了65.0%（P=0.0003）,lnc RNA021545表达降低了40.6%（P=0.044）,在Hu H7细胞中,mi R-330-3p上调使内源性EREG m RNA表达降低了94.3%（P=0.0012）,蛋白水平表达降低了57.7%（P=0.0009）,lnc RNA021545表达降低了45.9%（P=0.0007）;在HCCLM3细胞中,mi R-330-3p下调使EREG m RNA表达升高了46.6%（P=0.0071）,蛋白水平表达升高了145.1%（P=0.0003）,lnc RNA021545表达升高了52.9%（P=0.0029）,在Hu H7细胞中,q RT-PCR结果表明:mi R-330-3p下调后EREG m RNA表达升高了51.4%（P=0.0357）,蛋白水平表达升高了94.3%（P=0.0357）,lnc RNA021545表达升高了79.3%（P=0.0012）;4.在HCCLM3细胞中,lnc RNA021545下调后EREG m RNA表达下调了45.8%（P=0.0001）,蛋白水平表达下调了33.3%（P=0.0023）,mi R-330-3p表达上调了60.6%（P=0.0097）;在Hu H7细胞中,lnc RNA021545下调后EREG m RNA表达下调了80.9%（P=0.0007）,蛋白水平表达下调了31.0%（P=0.0006）,mi R-330-3p表达上调了52.0%（P＜0.0001）;5.获得EREG表达稳定上调的细胞株,在m RNA及蛋白表达水平分别升高了317.10%（P＜0.0001）,59.33%（P=0.032）;瞬时转染获得了EREG下调的细胞株,在m RNA及蛋白表达水平分别降低了69.63%（P=0.0007）,39.00%（P=0.0010）;6.MTT结果表明:mi R-330-3p、EREG和lnc RNA021545表达变化对HCCLM3和Hu H7细胞体外增殖能力无影响。7.Transwell结果表明:与HCCLM3-mi R-NC相比,HCCLM3-mi R-330-3p mimic组迁移、侵袭能力分别升高了98.93%（P=0.0008）,84.98%（P=0.0037）,与Hu H7-mi R-NC相比,Hu H7-mi R-330-3p mimic组迁移、侵袭能力分别升高了66.91%（P=0.0050）,70.39%（P=0.0074）;与对照组相比,HCCLM3-mi R-330-3p inhibitor组迁移能力降低了52.01%（P=0.0006）,侵袭能力降低了25.27%（P=0.0334）,与对照组相比,Hu H7中mi R-330-3p下调组的迁移、侵袭能力分别降低了40.39%（P=0.0001）,48.04%（P=0.0003）;与HCCLM3-PCDH-NC相比,HCCLM3-PCDH-EREG组迁移和侵袭能力各减弱了54.27%（P=0.0005）和59.21%（P=0.0116）;与Hu H7-si-NC相比,Hu H7-si-EREG迁移、侵袭能力分别升高了46.07%（P=0.0376）和65.68%（P=0.0194）。与对照组相比,HCCLM3-si-lnc RNA021545组迁移、侵袭能力分别升高了68.52%（P=0.0020）和62.66%（P=0.0042）,与Hu H7-si-NC相比,Hu H7-si-lnc RNA021545组迁移、侵袭能力分别升高了70.88%（P=0.0003）和107.15%（P=0.0044）。8.mi R-330-3p、EREG和lnc RNA021545影响EMT通路分子表达:在HCCLM3和Hu H7细胞中,mi R-330-3p上调后snail表达水平分别增加了46.0%（P=0.0048）和45.0%（P=0.0024）,slug表达水平分别增加了57.0%（P=0.0442）和59.3%（P=0.0182）,E-cadherin表达水平分别降低了47.0%（P=0.0044）和33.0%（P=0.0008）,N-cadherin表达水平分别增加了96.7%（P=0.0168）和71.7%（P=0.0084）,vimentin表达水平分别增加了49.0%（P=0.0062）和56.3%（P＜0.0001）;在HCCLM3和Hu H7细胞中,下调mi R-330-3p表达后,EMT转录因子snail表达水平分别降低了46.7%（P=0.0069）和36.0%（P=0.0124）,slug表达水平分别降低了44.3%（P=0.0446）和45.7%（P=0.0388）,E-cadherin表达水平分别增加了63.3%（P=0.0332）和72.0%（P=0.0070）,N-cadherin表达水平分别降低了38.7%（P=0.0130）和66.0%（P＜0.0001）,vimentin表达水平分别降低了33.0%（P=0.0002）和31.7%（P=0.0009）;在Hu H7细胞中下调EREG表达后,snail和slug表达水平分别增加了46.7%（P=0.0136）和35.0%（P=0.0137）,E-cadherin表达水平降低了41.5%（P＜0.0001）,N-cadherin和vimentin表达水平分别增加了51.0%（P=0.0148）和77.7%（P=0.0339）。在HCCLM3细胞中过表达EREG,导致snail和slug表达水平分别降低38.3%（P＜0.0001）和39.3%（P=0.0013）,E-cadherin表达水平增加了33.5%（P=0.0012）,而N-cadherin和vimentin表达水平分别降低了44.0%（P=0.0013）和38.7%（P＜0.0001）;在Hu H7和HCCLM3细胞中下调lnc RNA021545后,snail表达水平分别增加了53.0%（P=0.0198）和50.3%（P=0.0005）,slug表达水平分别增加47.3%（P=0.0013）和55.3%（P=0.075）,E-cadherin表达水平降低了44.0%（P=0.0009）和31.0%（P=0.0034）,N-cadherin表达水平分别增加了58.0%（P=0.0450）和72.3%（P=0.0346）,vimentin表达水平分别增加了71.7%（P=0.0108）和56.3%（P=0.0353）;9.补救实验:在HCCLM3细胞中mi R-330-3p模拟物和PCDH-EREG共转染48h后,相对于mi R-330-3p mimic组,mi R-330-3p mimic+PCDH-EREG组中EREG m RNA水平表达升高了43.0倍（P＜0.0001）,蛋白水平表达升高了139.8%（P=0.0004）,相对于PCDH-EREG组,mi R-330-3p mimic+PCDH-EREG组EREG m RNA水平表达降低了95.80%（P=0.0001）,蛋白水平表达降低了16.56%（P=0.0459）;同时Transwell验证发现,相对于mi R-330-3p mimic组,mi R-330-3p mimic+PCDH-EREG组迁移、侵袭能力减弱,而相对于PCDH-EREG组,mi R-330-3p mimic+PCDH-EREG组迁移、侵袭能力增强;相对于HCCLM3-mi R-330-3p组,HCCLM3-mi R-330-3p+PCDH-EREG EMT转录因子snail、slug表达水平分别减少了42.4%（P=0.0017）、50.3%（P=0.0007）,E-cadherin表达水平增加了159.3%（P=0.0031）,N-cadherin和vimentin表达水平分别减少了43.8%（P=0.0027）和43.9%（P=0.0007）;相对于PCDH-EREG组,HCCLM3-mi R-330-3p+PCDH-EREG EMT转录因子snail和slug表达水平分别增加了35.1%（P=0.0257）和24.6%（P=0.0489）,E-cadherin表达水平降低了31.4%（P=0.0337）,N-cadherin和vimentin表达水平分别增加了30.1%（P=0.0225）和53.7%（P=0.0496）;10.在裸鼠成瘤实验中,21只小鼠均形成实体瘤,与对照组相比,mi R-330-3p上调组的质量增加了148.3%（P=0.0358）,mi R-330-3p下调组的质量无明显变化;与对照组相比,mi R-330-3p上调组体积增加了148.3%（P=0.0358）,mi R-330-3p下调组的体积无明显变化。与HCCLM3-mi R-NC组相比,mi R-330-3p上调组的淋巴细胞弥散分布,体积大,呈圆形,核大,嗜碱性染色,而mi R-330-3p下调组具有深染清晰的细胞核;与HCCLM3-mi R-NC相比,mi R-330-3p上调组实体瘤中mi R-330-3p的表达水平上调了1195.3%（P=0.0209）,EREG在m RNA水平表达降低了81.4%（P=0.0249）,lnc RNA021545的表达水平降低了66.1%（P=0.0384）,与HCCLM3-mi R-NC相比,mi R-330-3p下调组实体瘤中mi R-330-3p的表达水平下调了26.5%（P=0.0231）,EREG在m RNA水平表达升高了147.0%（P=0.0025）,lnc RNA021545的表达水平升高了151.8%（P=0.0005）;对各实验组织体外成瘤进行免疫组织化学染色并进行H-Score评分,与HCCLM3-mi R-NC组相比,HCCLM3-mi R-330-3p-mimic组EREG、E-cadherin的表达水平分别减少了42.9%（P＜0.0001）、82.8%（P＜0.0001）,N-cadherin、vimentin、snail、slug的表达分别增加了43.0%（P＜0.0001）、44.9%（P=0.0002）、31.5%（P＜0.0001）、30.2%（P=0.0019）,而ki67的表达无明显变化;同时与HCCLM3-mi R-NC组相比,HCCLM3-mi R-330-3p inhibitor组EREG、E-cadherin的表达分别增加了45.1%、101.42%,N-cadherin、vimentin、snail、slug的表达分别减少了52.86%（P＜0.0001）、37.04%（P=0.0002）、42.89%（P＜0.0001）、37.53%（P=0.0009）,ki67的表达无明显变化。结论:1.mi R-330-3p在肝癌样本中高表达,EREG、lnc RNA021545在肝癌样本中低表达,二者呈正相关;mi R-330-3p与EREG、lnc RNA021545在肝癌样本里表达成负相关。2.在HCCLM3和Hu H7细胞中,mi R-330-3p上调能够抑制EREG和lnc RNA021545的表达,下调则促进。3.在HCCLM3和Hu H7细胞中,lnc RNA021545表达下调促进EREG、抑制mi R-330-3p的表达。4.mi R-330-3p表达水平上升,促进HCCLM3和Hu H7细胞的迁移、侵袭;mi R-330-3p表达水平减少其迁移、侵袭能力减弱;EREG过表达抑制HCCLM3细胞的迁移、侵袭,表达水平下降促进Hu H7细胞的迁移、侵袭;lnc RNA021545表达水平降低,HCCLM3和Hu H7细胞迁移侵袭能力增强,而对增殖无影响。5.lnc RNA021545-mi R-330-3p-EREG通过调控EMT相关蛋白的表达调控肝癌细胞恶性行为。