鲟鱼性腺溃烂病和肿嘴病病原菌分离鉴定与防治药物筛选

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自20世纪90年代中国开展鲟鱼人工养殖以来,涉及鲟鱼品种较多,养殖产量也位居世界首位,在全世界鲟鱼养殖业占有重要的地位。特别是近年来,鲟鱼商品形式呈现多样化,鲟鱼养殖具有巨大的市场前景。但是因鲟鱼在国内养殖起步较晚,养殖技术特别是鱼病防治技术跟不上养殖生产需要,在鲟鱼人工养殖过程中常出现重大细菌性疾病,引起较大经济损失。因此开展鲟鱼重大细菌性疾病的研究具有重要的现实意义。本研究通过流行病学调查总结鲟鱼养殖生产中的重大细菌性疾病,通过对导致其发病生物因素及非生物因素进行分析,以确定其发病机制;通过分离纯化鉴定及回归感染确定病原后筛选出有效抗菌药物用于疾病防治,结合发病环境因素确定疾病防治方案。本次研究的主要结果如下:  1西伯利亚鲟性腺溃烂病病原分离鉴定及药敏特性研究  从已经患病濒临死亡的西伯利亚鲟的肝脏、肾脏以及性腺等组织器官上均分离到2株高致病性的菌株HD0923及HD0824,感染该病原菌后的西伯利亚鲟表现为生殖孔溃烂,脾脏发黑,性腺有点状出血,继而发生严重溃烂。分离到的菌株经纯化后,通过常规生理生化鉴定,结果表明菌株HD0923可能是鲁氏耶尔森氏菌,非发酵型需氧,革兰氏阴性短杆菌,在5%绵羊血平板上不产生溶血现象;菌株HD0824为革兰氏阴性杆,无芽孢和荚膜,在兔血平板上能形成明显的β-溶血,蛋白酶活性很强。对分离株HD0923和菌株HD0824的16S rDNA基因片段序列通过PCR基因扩增手段与测定核苷酸排列顺序分析方法,并与NCBI中收录的16S rDNA基因序列进行同源性比对,并构建系统发育树。结果表明分离株HD0923的16S rDNA基因序列与NCBI中收录的鲁氏耶尔森氏菌的16S rDNA基因序列同源性为100%,在系统进化树上与鲁氏耶尔森氏菌聚为一簇,进一步确定分离到的菌株HD0923为鲁氏耶尔森氏菌;分离病原菌HD0824被确定是嗜水气单胞菌,与嗜水气单胞菌同源性达99%。而从人工感染后发病西伯利亚鲟的肝组织、肾组织以及性腺组织再人工纯化到此2株致病性菌株,由此可以确定鲁氏耶尔森氏菌及嗜水气单胞菌是西伯利亚鲟此病的致病菌。分离株HD0923强力霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、链霉素、先锋霉素V、阿莫西林、阿奇霉素、左氧氟沙星、痢特灵、庆大霉素10种药物高度敏感,对红霉素、氯霉素、头孢噻肟、利福平、新霉素5种药物中等敏感;分离菌株HD0824对庆大霉素、强力霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、头孢噻肟、阿奇霉素及左氧氟沙星8种药物高度敏感,对新霉素中度敏感。  2鲟源弗氏柠檬酸杆菌分离鉴定及药敏特性研究  从患鲟鱼肿嘴病的施氏鲟的体内分离纯化到2株优势菌,分别命名为HD0102及HD0103。分别经人工感染后,注射菌株HD0103的试验用施氏鲟出现死亡,经诊断与自然发病死亡症状相似,确定菌株HD0103为鲟鱼该病病原菌。菌株HD0103为革兰氏阴性菌,无芽孢和荚膜。经过分别对生理学反应以及生化学反应特性及16S rDNA基因序列测定,分离病原菌HD0103与弗氏柠檬酸杆菌同源性达100%,结合其生理生化特性确定分离病原菌HD0103为弗氏柠檬酸杆菌。弗氏柠檬酸杆菌对磺胺异噁唑、氯霉素、多黏霉素B、环丙氟哌酸、氟苯尼考、诺氟沙星、阿奇霉素、头孢噻肟、新霉素、强力霉素、左氧氟沙星、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素等15种药物高度敏感,对痢特灵、红霉素、卡那霉素等3种药物中度敏感。该结果为鲟鱼养殖生产中对该病的防治提供了科学依据。  341种中草药对鲟3种病原菌体外抑菌效果  采用平板打孔法在观察了弗氏柠檬酸杆菌、鲁氏耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌等3种鲟源病原菌对41种中草药敏感性的基础上,进一步采用二倍稀释法测定了具有良好抑菌活性的中草药对3种病原菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。实验结果表明,3种病原菌对乌梅、石榴皮、地榆、杞子等均高度敏感,对杜仲、柴胡、丹参、熟地黄等均中度敏感,对麦冬、当归、胖大海、玉竹均不敏感。此外,乌梅、石榴皮、地榆、杞子对3种病原菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为7.81 mg/mL和15.625 mg/mL、15.625 mg/mL和31.25 mg/mL、15.625 mg/mL和31.25 mg/mL以及15.625 mg/mL和31.25 mg/mL,而杜仲、柴胡、丹参、熟地黄等中度敏感中草药对3种病原菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均分别高于31.25 mg/mL和62.5 mg/mL。  47种消毒剂对鲟3种病原菌体外抑菌效果  为了筛选高效的消毒剂用于防治鲟细菌性疾病,采用二倍稀释法测定了7种消毒剂对鲟3种病原菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)。结果显示,高铁酸钾对鲟3种病原菌抑菌效果最好,MIC为8 mg/L,MBC为8-16 mg/L,戊二醛、甲醛、苯扎溴铵、过氧化氢及季铵盐络合碘5种消毒剂抑菌效果中等,聚维酮碘对鲟3种病原菌抑菌效果最差,聚维酮碘对鲟3种病原菌的MBC最大值为2048 mg/L。根据上述研究结果,选择抑菌效果好的消毒剂高铁酸钾进一步研究了鲟3种病原菌随时间和高铁酸钾浓度变化的生长趋势,显示消毒液浓度为5 mg/L、9 mg/L的消毒液在短时间能抑制病原菌生长繁殖,病原菌数量同样能在短时间内繁殖恢复到原来的水平,浓度为13 mg/L、17 mg/L的高铁酸钾消毒液能快速杀灭病原菌,病原菌在较长时间维持在较低水平,甚至病原菌全部被杀死。研究对于使用高铁酸钾防治鲟养殖实践中的疾病具有重要的指导意义。
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