石杉碱甲(HuperzineA，HupA)是从民间草药千层塔(Huperzia Serrata)中分离得到的一种高效、可逆、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。其制剂石杉碱甲片剂与胶囊剂已被中国FDA批准投产上市。临床实践表明，石杉碱甲对改善中老年记忆减退和阿尔茨海默病(AD)患者记忆能力和认知能力均有明显的作用，是当前国内外治疗早老性痴呆症的最有效药物之一。 与已上市的同类药物E2020，Tacrine，Physostigmine，Galanthamine相比，石杉碱甲更具高效、低毒等优点。 石杉碱甲的来源主要从野生植物千层塔中直接提取。由于千层塔中石杉碱甲的含量很低(0.007％，w／w)，且生长缓慢，因此，其来源十分有限，难以满足临床需要。另外，千层塔的天然资源有限，大量采伐还涉及到未来的生态环境问题。有人采用生物技术对千层塔进行组织细胞培养，认为是一条有希望的替代途径。这方面的研究工作虽很受关注，但细胞培养至今未有实际应用。 自80年代以来，国内外对石杉碱甲的化学合成及其结构修饰进行了大量的研究，但是，化学合成石杉碱甲工艺复杂、得率低、成本高，至今仍无实际应用价值。 利用现代分子生物学和基因工程技术手段，克隆石杉碱甲生物合成途径的关键酶基因，研究关键酶基因对石杉碱甲生物合成的调控规律，弄清石杉碱的生物合成途径及其代谢调控机制，实施次生代谢工程，是应用生物技术方法大量生产石杉碱及其衍生物的有效途径。该项研究不仅有很高的科学价值，而且能产生很好的社会效益和经济效益。 IaIl Spenser等提出了关于石松生物碱(包括石杉碱甲)的生物合成途径假说，即在聚酮合酶催化作用下，△<1>-piperideine脱羧形成4PAA／4PAACoA和石松属生物碱生物合成的第一个中间体石榴碱(pelletierine)，并以此为起始底物，在聚 酮合酶或其他相关性酶的协同作用下，可催化生成石杉碱甲。Ⅲ型聚酮合酶(Type Ⅲ polyketide synthases，PKSs)中的查尔酮合酶超家 族(CHS superfamily)广泛存在于植物中，能催化产生一系列结构各异、具有不同生理活性的的植物次生代谢产物，如生物碱(吖啶酮)、类黄酮(查尔酮、 二苯乙烯、苯甲酮、间苯三酚、间苯二酚、吡喃酮、苯并-γ-吡喃酮等)。 对聚酮合酶的基因调控可用于生物合成一些靠化学方法难以得到的新型化合物。基因调控的成功有赖于不断的发现能催化形成不同产物的聚酮合酶。 目前已从芸香、大黄、雏菊等植物中进行了Ⅲ型聚酮合酶(查尔酮合酶超家族)基因的克隆和表达，而对千层塔中的Ⅲ聚酮合酶基因研究，国内外至今未见报道。 本研究之目的在于探索民间草药千层塔中能催化生成具有次生代谢产物核心结构的Ⅲ型聚酮合酶，开展石杉碱甲生物合成相关基因的分子克隆及原核表达研究，从而为其功能鉴定与石杉碱甲生物合成的分子调控打下基础，为最终实现利用生物工程技术生产石杉碱甲创造有利条件。 本研究共分三个部分： 第一部分进行了千层塔中Ⅲ型聚酮合酶基因的克隆研究。从千层塔新鲜嫩叶中提取总RNA，在逆转录酶的作用下以Oligo（dT)<,12-18>为引物合成第一链cDNA，以此为模板；同时，通过GenBank搜索大黄等植物的Ⅲ型聚酮合酶的氨基酸序列，用DNAStar中的MegAlign软件进行同源性比较，根据CHS中高度保守的序列，设计简并引物。经套式PCR扩增，扩增产物连接到<,P> T7 Blue T-载体，提取质粒，测序确定核心序列；根据已知的核心序列，设计基因特异引物，与cDNA末端的通用引物组合，经3＇RACE和5＇RACE快速扩增出eDNA的5＇端和3＇端片段。再根据5＇端和3＇端序列设计引物，通过PCR扩增得到全长cDNA。 结果表明，采用RT-PCR方法，首次从千层塔中克隆并得到两个与生物合成相关的Ⅲ型聚酮合酶全长cDNA，经序列测定证实具有完整的阅读框架。序列分析表明，该序列与查尔酮合酶超家族基因具有很高的同源性，同时具有Ⅲ型聚酮合酶高度保守的催化活性中心(Cys-His-Asn)。 第二部分进行了千层塔中Ⅲ型聚酮合酶基因在大肠杆菌(E.coli)M15中的表达研究。将其中-cDNA全长序列经SalI和PstI双酶切后克隆至pQE81L原核表达载体的酶切位点上，测序证明克隆片段准确无误。将表达质粒转化E-coli M15宿主菌中，结果表明，该质粒在IPTG诱导下能表达产生大量带寡聚组氨酸标记的重组酶。经过与组氨酸结合金属螯合树脂亲和柱层析纯化后，得到纯化的重组酶(H.s PKSl)。经SDS-PAGE确定其分子量大小为45.8 kDa。 第三部分对重组酶的活性测定进行了初步研究。结果表明，H.s PKSl重组酶具有较高的酶催化活性。H．s PKSl具有广泛的底物特异性，可催化芳香族底物、脂肪族底物生成系列产物。PH依存性研究结果表明，H.serrata PKSl酶反应的最佳pH为pH 7.5磷酸钾缓冲液或pH 9.0 Tris-HCl。已发现，H.serrata PKS1可催化N-methylanthraniloyl-CoA与1分子丙二酰辅酶A生成含氮化合物4-hvdroxy-1-methyl-2(1H)-quinolone，此化合物以前未见报道。 小结 根据对GenBank中已知植物的Ⅲ型聚酮合酶的氨基酸序列进行同源性比较获得的CHS中高度保守的序列，设计简并引物，采用RT-PCR方法，首次从民间草药千层塔植物中成功克隆得到Ⅲ型聚酮合酶，并在原核表达系统中大量表达。此重组酶具有较高的酶催化活性和广泛的底物特异性，可催化芳香族底物、脂肪族底物生成系列产物。PH依存性研究结果表明，H.serrata PKS1酶反应的最佳pH为pH7.5磷酸钾缓冲液或pH9.0Tris-HCI。已发现，H.serrtaPKSl可催化N-methylanthraniloyl-CoA与1分子丙二酰辅酶A生成含氮化合物4-hydroxy-1-methyl-2(1H)-quinolone，提示H.serrata PKS1与含氮化合物的生物合成有关。本工作为石杉碱甲生物合成的调控提供了科学依据。