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布氏杆菌病(Brucellaellosis)也称布鲁菌病(布病),是由布氏杆菌感染引起的一种最为常见的人兽共患传染病之一,其中又以牛种和羊种布氏杆菌最为严重。布氏杆菌被列为必须报告病原体,除了少数已经根除布病的国家,布病广泛地分布于世界各地,我国也是布病流行极为严重的国家之一。最近几年,布病在世界范围内呈反弹趋势,给公共卫生安全及畜牧业发展而带来了巨大的经济损失,布病防控形势十分严峻。由于目前尚未有理想的治疗药物,因此对布病的准确诊断是预防该病的关键。目前对布病的检测方法主要是血清学方法,包括试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、聚合酶链式反应(PCR)和荧光偏振免疫分析法(FPIA)等。但是由于布氏杆菌的脂多糖(LPS)与另外一些革兰阴性菌,特别是耶尔森菌09和大肠杆菌0157表面的LPS的结构存在相似成分,因此在检测中往往会发生交叉反应而出现假阳性的检测结果。鉴于此,本研究制备了具有特异性的抗牛种布氏杆菌的单克隆抗体,并且利用该单克隆抗体建立了检测布氏杆菌抗体的竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)方法,通过与商品化布病检测试剂盒的比较,证明本研究的cELISA方法能够有效地排除以耶尔森菌09和大肠杆菌0157为代表的典型革兰氏阴性菌引起的假阳性的结果,在布病根除计划中将具有重要应用价值。1.抗布氏杆菌单克隆抗体的研制及特性鉴定本研究用灭活的牛种布氏杆菌S2308免疫BALB/c小鼠,按常规方法免疫三次后进行加强免疫,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合。将牛种布氏杆菌A99、耶尔森菌09和大肠杆菌0157分别包被酶标板,用间接酶联免疫吸附试验(iELISA)对杂交瘤细胞进行筛选,结果获得2株稳定分泌抗布氏杆菌抗体的杂交瘤细胞株Brucella-5C10和Brucella-4D2。对该2株杂交瘤进行特性分析,结果表明,Brucella-5C10腹水效价为1：64000,亚类鉴定为IgG3/X; Brucella-4D2腹水效价为1：32000,亚类鉴定为IgG3/λ。试管凝集试验结果表明,2株单克隆抗体与牛种布氏杆菌S2308、牛种布氏杆菌A99、羊种布鲁氏菌16M能发生较强凝集作用；而与耶尔森菌09、大肠杆菌0157无明显凝集现象。免疫印迹法(Western-blot)结果显示,该2株单克隆抗体与布氏杆菌菌体蛋白具有明显反应性,而与耶尔森菌09、大肠杆菌0157无明显反应。本研究所获得的2株单克隆抗体为组建检测动物血清中布氏杆菌抗体的cELISA试剂盒提供了优良的生物材料。2.布氏杆菌抗体竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)检测试剂盒的研制为检测待检血清中布氏杆菌抗体,利用牛种布氏杆菌A99作为抗原包被酶标板,利用Brucella-5C10作为竞争抗体,HRP标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体组建了cELISA试剂盒。优化试验结果表明,当牛种布氏杆菌A99按4μg/孔包被；单克隆抗体按1：4000稀释；待检血清按1：20稀释；酶标二抗按1：10000作为工作浓度时本研究建立的cELISA方法检测结果最适。通过ROC分析,本研究建立的cELISA方法确定抑制率30%作为临界值,其敏感性(DSn)和特异性(DSp)在95%置信度(CI)下分别为93.3%和96.2%。用本研究建立的cELISA方法检测临床样品320份牛血清和147份羊血清,并与商品化布病cELISA检测方法作比较。结果表明,两种cELISA方法共同检测出牛血清样品中167份阳性和139份阴性,出现了14份差异样品,符合率为95.6%；共同检测羊血清样品112份阳性和24份阴性,出现了11份差异样品,符合率为92.5%。进一步用CFT验证其中的25份差异样品,结果本研究建立的cELISA与CFT符合率为85%(21/25)。另外,利用该方法检测牛羊种耶尔森菌09的高免血清,结果证明当高免血清的抗体浓度小于200 IU/ml时,本研究组建的cELISA试剂盒不会出现假阳性结果。综上所述,本研究建立的cELISA检测试剂盒具有良好的特异性和灵敏度,能够更好的排除由典型的交叉菌耶尔森菌09和大肠杆菌0157造成的假阳性现象,为布病的准确诊断提供了一种有效的血清学检测工具。