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原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,病死率高,复发转移是影响预后的最主要因素。肝癌细胞的侵袭转移能力与其产生降解细胞外基质(ECM)的蛋白水解酶能力密切相关。目前针对ECM相关蛋白酶的生物治疗已经成为肝癌治疗研究的热点,其中蛇毒活性成分的药用价值更是不断得到认可。我们前期克隆了蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)和蛇毒金属蛋白酶抑制剂(BJ46a)基因,初步证明其各自具有抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的侵袭转移功能。鉴于sv-Cystatin和BJ46a抑制肿瘤侵袭转移作用的靶点不同,我们设想二者联合表达存在协同作用的可能。为此,我们应用双基因真核表达载体将sv-Cystatin和BJ46a同时导入人的高转移肝癌细胞株MHCC97H,通过体外和动物在体实验研究各自的抗肝癌侵袭转移作用、协同作用和存在的新功能,探讨两种基因的表达对肝癌细胞影响的可能分子机制,并利用重组sv-Cystatin与BJ46a腺病毒观察体内应用的初步治疗效果。一、表达sv-Cystatin或/和BJ46a基因的MHCC97H细胞株的建立利用分子克隆技术构建了重组表真核达载体pBudCE4.1/sv-Cystatin、pBudCE4.1/BJ46a和pBudCE4.1/sv-Cystatin+Bj46a;经Western Blot证实建立的细胞株MHCC97H/sv-Cystatin、MHCC97H/BJ46a和MHCC97H/sv-Cystatin+Bj46a可以分别稳定表达sv-Cystatin、BJ46a和同时表达sv-Cystatin和BJ46a,为后续研究提供了实验材料。二、sv-Cystatin或/和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移功能的影响体外细胞活力和裸鼠皮下肝癌细胞原位瘤重分析表明,表达sv-Cystatin能显著地抑制MHCC97H细胞的体外、体内增殖能力,但sv-Cystatin和BJ46a共同表达时没有协同作用。细胞培养中发现表达sv-Cystatin可以使MHCC97H细胞具有聚集成团倾向,细胞间连接更为紧密,并具有抑制MHCC97H细胞体外趋化的作用。利用Transwell--Matrigel实验和裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型证实表达sv-Cystatin和BJ46a具有各自抑制MHCC97H细胞体外、体内侵袭转移的作用,共表达时具有协同作用。三、sv-Cystatin或/和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移影响的分子机制流式细胞检测、电镜观察和TUNEL实验证实诱导凋亡是表达sv-Cystatin的MHCC97H细胞生长增殖能力降低的原因,其可能的机制为sv-Cystatin的表达下调Twist表达,降低Twist所介导的抑制P53分子通路的保护细胞作用,直接导致促凋亡作用的P53表达升高及其靶分子Bax的上调,启动凋亡线粒体通路级联反应。BJ46a不具有此功能,故sv-Cystatin和BJ46a共表达时没有体现诱导凋亡的协同作用。细胞培养上清通过荧光分光光度检测Cathepsin B、明胶酶谱分析MMPs,培养细胞通过凝胶迁移分析转录因子Twist活性及其相关的E-cadherin和N-cadherin表达等证明:(1)MMP2和MMP9的活性的下降是表达BJ46a的MHCC97H细胞侵袭能力减弱的直接原因;(2)CathepsinB、MMP2和MMP9活性的同时下降,Twist活性减弱导致的E-cadherin表达上调和N-cadherin表达下调共同促成了表达sv-Cystatin的MHCC97H细胞侵袭能力的抑制;(3)以上二者因素的协同作用导致同时表达sv-Cystatin和BJ46a的MHCC97H细胞的侵袭能力最弱。四、重组sv-Cystatin和BJ46a腺病毒治疗转移性肝癌的实验研究利用腺病毒载体pShuttle-IRES-hrGFP-1构建了携带sv-Cystatin和BJ46a基因的重组腺病毒。通过裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型的瘤内注射治疗实验证实Ad/sv-Cystatin可以降低MHCC97H细胞的肺转移率30.4%,而联合注射Ad/sv-Cystatin和Ad/BJ46a可降低28%,未见协同作用;瘤内注射Ad/sv-Cystatin在一定程度上具有抑制MHCC97H细胞生长的作用。