研究背景:脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是一种由创伤性或非创伤性因素所导致脊髓暂时或永久性的横断损害和功能减退或丧失,表现为脊髓损伤水平以下肌肉运动障碍、感觉的减退或丧失以及自主神经功能障碍。多数情况下,有创伤性因素（如车祸、暴力枪伤、高处坠落、体育事故等直接损害）和非创伤性原因（如细菌病毒感染、血流量不足,肿瘤等疾病的间接损伤）导致。另外,SCI亦可继发于椎间盘疾病和脊髓血管疾病。SCI是世界范围内的一个重要临床问题,其发病机制复杂,尚不十分清楚。SCI是一种严重的损伤,可引起即刻的机械损伤和随后的组织变性,后者常涉及缺血、水肿、电解质紊乱等生理生化反应。SCI损伤导致的继发性损伤可进一步损伤脊髓。缺血缺氧和炎症会促进产生和释放活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）,ROS的大量聚集会引起局部组织的氧化损伤、神经细胞凋亡甚至坏死。因此,寻找有效的、能减少活性氧自由基产生、保护神经元免受损伤的药物一直是脊髓损伤治疗研究的热点。热休克蛋白70 kDa（Heat shock protein 70,HSP70）是热休克转录因子（Heat shock factor,HSF）家族的重要成员,表达在细胞质、内质网和线粒体中。HSP70在维持细胞内稳态和防止温度升高或其它环境改变导致的蛋白损伤中起到十分重要的作用。此外,HSP70是一种高度保守的分子,可表达在不同的物种、组织、细胞中。HSP70在瘢痕组织中的成纤维细胞中表达升高,而且过表达的HSP70与瘢痕中成纤维细胞产生过度胶原密切相关。此外,动物实验证明,HSP70参与了炎症反应,并且是HSP70是治疗肠道炎症的靶点。大部分是通过什么机制完成?尽管以往的研究已经对HSP70的功能分析有了很大进展,但HSP70在SCI中的作用机制的研究仍较少。此外,HSP70作为分子伴侣,可作用于许多蛋白,其中,有研究表明,HSP70对Wnt/β-catenin信号通路具有激活作用。因此,我们猜测,在SCI中HSP70可通过Wnt/β-catenin信号通路参与SCI的发生发展。为了验证这种猜测,本课题进行了三部分实验。第一部分旨在观察HSP70和Wnt/β-catenin信号通路在SCI大鼠中是否存在差异性表达,并探讨HSP70与Wnt/β-catenin的相关性。第二部分实验是在第一部分实验的基础上,选择上调或者下调HSP70,观察HSP70对大鼠运动及Wnt/β-catenin的作用,并进一步探讨这种作用是否影响神经元凋亡。第三部分在细胞水平对第二部分的结论进行验证。结合上诉实验结果,得出相应结论。本研究从经典的分子和信号通路为切入点,探讨SCI的发病机制,首次在SCI模型中揭露并验证了 HSP70与Wnt/β-catenin的关系。第一部分 HSP70、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin在脊髓损伤大鼠中的表达研究目的:检测HSP70、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin在脊髓损伤大鼠中的表达变化,为后续机制研究提供理论依据。研究方法:1.成年雄性SD大鼠,于T9-T10水平用微血管夹挤压脊髓诱导SCI模型,建模成功的大鼠为SCI组（n=15）;行相同处理,但未于T9～T10水平用微血管夹挤压脊髓的大鼠为对照组（control;n=15）。获得T9～T10水平的脊髓组织。2.免疫共沉淀检测 HSP70 与 Wnt3a、HSP70 与 Wnt5a 及 HSP70 与 β-catenin的相关性。3.RT-qPCR检测HSP70、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin在脊髓损伤大鼠模型中的表达水平。4.免疫印迹方法检测HSP70、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin在脊髓损伤大鼠模型中的表达水平。研究结果:1.免疫共沉淀证实 HSP70 与 Wnt3a、HSP70 与 Wnt5a 及 HSP70 与 β-catenin具有相关性。2.在 SCI 大鼠模型中,RT-qPCR 证实 HSP70、Wnt3a、Wnt5a 和 β-catenin在mRNA水平表达降低（P<0.05）。3.在SCI大鼠模型中,免疫印迹方法证实HSP70、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin在蛋白水平表达降低（P<0.05）。结论:1.HSP70与Wnt/β-catenin信号通路有相互作用。2.HSP70在SCI大鼠中表达降低,且Wnt/β-catenin信号通路在SCI大鼠中被抑制。第二部分 上调HSP70通过激活Wnt/β-catenin信号通路继而抑制caspase3凋亡途径缓解脊髓损伤研究目的:为了进一步探讨HSP70在SCI中的作用,应用腺病毒上调SCI大鼠中HSP70的表达以及XAV-939抑制Wnt/p-catenin信号通路,了解HSP70是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路继而抑制caspase3凋亡途径缓解脊髓损伤。研究方法:1.腺病毒复制的验证:将20只正常大鼠随机分为空病毒组（Ad-con组）和HSP70过表达组（Ad-HSP70组）。病毒注射于T9～TI 0水平的脊髓,7d后取脊髓组织。一部分脊髓组织制备冰冻切片显微镜下观察病毒荧光;另一部分则行免疫印迹实验检测HSP70的表达情况。2.XAV-939抑制效果的验证:将20只正常大鼠随机分为生理盐水组（NS组）和XAV-939组。XAV-939组大鼠每天腹腔注射100 μM的XAV-939,一共持续28 d;而NS组大鼠每天注射等量的生理盐水,持续28 d。28 d后在麻醉下取出T9～T10水平的脊髓组织,行免疫印迹实验检测Wnt3a、Wnt5a和β-catenin 的表达。3.上调HSP70对SCI大鼠及Wnt/β-catenin信号通路的影响:将60只大鼠随机分为SCI组,SCI+空病毒治疗组（SCI+Ad-con组）和SCI+HSP70过表达组（SCI+Ad-HSP70组）。所有大鼠造SCI模型。而SCI+Ad-con组和SCI+Ad-HSP70组大鼠则在造模前分别向T9～T10水平的脊髓注射3 μ1的Ad-con 和 Ad-HSP70。在造模第 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 和 28 d 行 Basso Beattie Bresnahan（BBB）评分;造模后28d,取T9～T10水平的脊髓组织,免疫印迹实验检测 HSP70、Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、Bcl-2、Bax、pro-caspase3 以及cleaved-caspase3的表达;造模后28d,取T9～T10水平的脊髓组织,制备冰冻切片,行TUNEL染色检测脊髓神经元的凋亡情况。4.XAV-939对HSP70及Wnt/β-catenin信号通路的影响:将40只大鼠随机分为 SCI+Ad-HSP70 组和 SCI+Ad-HSP70+XAV-939 组。所有大鼠造 SCI 模型。SCI+Ad-HSP70组和SCI+Ad-HSP70+XAV-939组大鼠则在造模前均在T9～T10水平的脊髓注射 3μl 的 Ad-HSP70。SCI+Ad-HSP70 组和 SCI+Ad-HSP70+XAV-939组大鼠在造模后每天分别腹腔注射生理盐水和100 的XAV-939,持续28 d。在造模第 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 和 28 d 行 Basso Beattie Bresnahan（BBB）评分;造模后28 d,取T9～T10水平的脊髓组织,免疫印迹实验检测HSP70、Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、Bcl-2、Bax、pro-caspase3 以及 cleaved-caspase3 的表达;造模后28 d,取T9～T10水平的脊髓组织,制备冰冻切片,行TUNEL染色检测脊髓神经元的凋亡情况。研究结果:1.腺病毒复制的验证:在腺病毒注射后第7 d的脊髓切片中可看到大量的绿色荧光。免疫印迹实验结果表明,HSP70在Ad-HSP70组大鼠中的表达明显高于 Ad-con 组（P<0.05）。2.XAV-939抑制效果的验证:免疫印迹实验结果表明,Wnt3a、Wnt5a和β-catenin在XAV-939组大鼠中的表达明显低于NS组（P<0.05）。3.上调HSP70对SCI大鼠及Wnt/β-catenin信号通路的影响:SCI+Ad-HSP70组大鼠的 BBB 评分明显高于 SCI+Ad-con 组（P<0.05）;HSP70、Wnt3a、Wnt5a、β-catenin和Bcl-2在SCI+Ad-HSP70组大鼠中的表达明显高于SCI+Ad-con组（P<0.05）,Bax和cleaved-caspase3在SCI+Ad-HSP70组大鼠中的表达明显低于SCI+Ad-con 组（P<0.05）,而 pro-caspase3 在 SCI+Ad-con 组和 SCI+Ad-HSP70组无明显变化（P>0.05）;TUNEL染色表明,SCI+Ad-HSP70组大鼠的脊髓神经元凋亡率明显低于SCI+Ad-con组（P<0.05）。SCI+Ad-con组与SCI组相比,上诉指标均无明显变化（P>0.05）。4.XAV-939 对 HSP70 及 Wnt/β-catenin 信号通路的影响:SCI+Ad-HSP70+XAV-93组大鼠的BBB评分明显低于SCI+Ad-HSP70组（P<0.05）;HSP70、Wnt3a、Wnt5a、β-catenin 和 Bcl-2 在 SCI+Ad-HSP70+XAV-93 组大鼠中的表达明显低于 SCI+Ad-HSP70 组（P<0.05）,Bax 和 cleaved-caspase3 在SCI+Ad-HSP70+XAV-93组大鼠中的表达明显高于SCI+Ad-HSP70组（P<0.05）,而 pro-caspase3 在 SCI+Ad-HSP70+XAV-93 组和 SCI+Ad-HSP70 组中无明显变化（P>0.05）;TUNEL染色表明,SCI+Ad-HSP70+XAV-93组大鼠的脊髓神经元凋亡率明显高于SCI+Ad-HSP70组（P<0.05）。结论:1.上调HSP70可改善SCI大鼠的运动障碍。2.上调HSP70可激活SCI大鼠中的Wnt/β-catenin信号通路。3.上调HSP70可抑制caspase3凋亡通路。第三部分 上调HSP70激活Wnt/β-catenin信号通路继而抑制caspase3凋亡途径保护PC-12细胞研究目的:为了进一步探讨HSP70在SCI中的作用,应用腺病毒上调PC-12细胞中HSP70的表达,了解HSP70是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路继而抑制caspase3凋亡途径缓解H2O2诱导的损伤。研究方法:1.腺病毒复制的验证:将PC-12细胞随机分为空病毒组（Ad-con组）和HSP70过表达组（Ad-HSP70组）。在培养液中加入2.5 MOI病毒液（Ad-con或Ad-HSP70）,24 h后用RT-qPCR和免疫印迹的方法检测HSP70的表达。2.上调HSP70对PC-12细胞及Wnt/β-catenin信号通路的影响:将PC-12细胞随机分为 Ad-con 组、Ad-HSP70 组、H2O2+Ad-con 组和 H2O2+Ad-HSP70组。病毒转染后 24 h,H2O2+Ad-con 组和 H2O2+Ad-HSP70 组加入 500 μM 的 H2O2,而Ad-con组和Ad-HSP70组加入等量的细胞培养液。24 h后行一下实验:①细胞内活性氧检测试剂盒检测ROS活性;②MTT检测细胞活力;③流式细胞仪检测细胞凋亡;④免疫印迹检测HSP70、Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、Bcl-2、pro-caspase3 以及 cleaved-caspase3 的表达。研究结果:1.腺病毒复制的验证:RT-qPCR结果表明,HSP70在Ad-HSP70组PC-12细胞中表达明显高于Ad-con组（P<0.05）。免疫印迹实验结果表明,HSP70在Ad-HSP70组大鼠中的表达明显高于Ad-con组（P<0.05）。2.上调HSP70对PC-12细胞及Wnt/β-catenin信号通路的影响:H2O2+Ad-con组 PC-12 细胞的 ROS 活性明显高于 Ad-con 组（P<0.05）;H2O2+Ad-HSP70组 PC-12 细胞的 ROS 活性明显低于 H202+Ad-con 组（P<0.05）。H202+Ad-con组PC-12细胞的细胞凋亡明显高于Ad-con组（P<0.05）;H2O2+Ad-HSP70组PC-12细胞的细胞凋亡明显低于H2O2+Ad-con组（P<0.05）。H2O2+Ad-con组PC-12细胞的细胞活力明显低于Ad-con组（P<0.05）;H2O2+Ad-HSP70组PPC-12细胞的细胞活力明显高于 H2O2+Ad-con 组（P<0.05）。Wnt3a、Wnt5a、β-catenin和Bcl-2在H2O2+Ad-con组PC-12细胞中的表达明显低于Ad-con组（P<0.05）;cleaved-caspase3 在 H2O2+Ad-HSP70 组 PC-12 细胞中的表达明显高于 Ad-con 组（P<0.05）;而 pro-caspase3 在 Ad-con 组和 H2O2+Ad-con 组无明显变化（P>0.05）。Wnt3a、Wnt5a、β-catenin 和 Bcl-2 在 H2O2+Ad-HSP70 组 PC-12 细胞中的表达明显高于 H2O2+Ad-con 组（P<0.05）;cleaved-caspase3 在 H2O2+Ad-HSP70组PC-12细胞中的表达明显低于H2O2+Ad-con组（P<0.05）;而pro-caspase3在 H2O2+Ad-con 组和 H2O2+Ad-HSP70 组无明显变化（P>0.05）。结论:1、H2O2诱导PC-12细胞损伤导致Wnt/β-catenin信号通路表达减少和Casβase3凋亡途径表达增多。2、上调HSP70可改善H2O2诱导PC-12细胞损伤。3、上调HSP70可激活Wnt/β-catenin信号通路和抑制Caspase3凋亡途径。