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随着心血管疾病发病率的逐年上升,特别是终末期心脏疾病患者的增加,现有的治疗手段愈发显现出局限性。针对终末期心脏疾病,现有的治疗方式主要是药物治疗、介入治疗,以及心脏移植。但是,药物治疗以及心脏介入治疗只能在一定程度上缓解相应的症状,并不能从根本上解决或者逆转心脏功能。心脏移植能使受损的心功能得到纠正,但是心脏移植由于存在供体不足,免疫排斥以及其他问题等而使其尚不是一种普遍的治疗方式。基于此,近年来,随着科技的发展,一种新的治疗方式—心肌组织工程开始迅速发展,有望成为未来心脏疾病的有效治疗方式。目的:通过冰浴超声的方法,构建碳纳米角/胶原(Carbon nanohorn/Collagen,CNH/Col)的复合基质材料,筛选出适宜于新生大鼠心肌细胞(Neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs)生长和心肌细胞分化的CNH/Col复合支架材料;体外研究基于CNH/Col复合基质材料对NRVMs粘附、增殖、分化及功能成熟的影响,以及CNH/Col复合基质材料对心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblast,CF)增殖活性的影响,评估碳纳米角(Carbon nanohorns,CNH)在心肌组织工程(Cardiac tissue engineering,CTE)中的应用前景。方法:通过冰浴超声的方法构建CNH/Col复合基质;通过透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)、原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)、电化学工作站等表征CNH/Col复合材料特性;采用胰酶消化法获取原代NRVMs细胞,采用Live/Dead染色、CCK-8法评估CNH/Col复合材料的生物相容性,筛选出毒性最小的浓度组作为实验浓度;通过免疫荧光染色、Western blotting等方法评估基于CNH/Col复合基质体外培养的NRVMs细胞电学蛋白connexin-43(Cx-43)及力学蛋白N-cadherin(NC)在不同时间点(3 d,7 d)的表达、分布等情况;通过细胞内自发钙瞬变检测评估基于CNH/Col复合基质体外培养的NRVMs细胞在不同时间点(3 d,7 d)的钙离子流差异,评估体外培养的心肌细胞的功能成熟程度;通过差速贴壁的方法,获取CF,通过Brd U染色法及CCK-8法评估CNH/Col复合基质材料对体外培养的CF增殖作用的影响。结果:TEM结果显示经过冰浴超声后,CNH能够很好的分散在胶原中,胶原分子包绕在CNH周围,CNH与胶原具有良好的亲和力;AFM显示掺入CNH后,CNH/Col复合材料组与胶原对照组相比,表面粗糙度明显增加;电化学工作站测量显示CNH浓度与复合材料的电导率、电容呈正相关,掺入CNH后明显增强了支架材料的导电性,差异具有统计学意义(P<0.05);通过胰酶消化法,得到原代NRVMs细胞,Live/Dead染色以及CCK-8法的结果显示0.05 mg/ml及0.1 mg/ml两个浓度CNH/Col组复合基质材料的细胞毒性低,具有良好的生物相容性;免疫荧光染色结果显示:与胶原对照组相比,在第3天和第7天两个时间点,在CNH/Col组接种的NRVMs细胞电学蛋白及力学蛋白(Cx-43和NC)的分布面积更广,并且随着培养时间的延长,培养第7天后,CNH/Col组Cx-43和NC蛋白呈现极化趋势,特别是Cx-43蛋白在细胞间区域呈现出明显的线性分布;Western blotting结果显示:培养3天后,0.1 mg/ml CNH-Col组NC蛋白表达量高于0.05 mg/ml CNH-Col组和胶原对照组,差异具有统计学意义(P<0.001),但是在第3天时间点,各组间Cx-43蛋白表达量无统计学差异;培养7天后,Cx-43蛋白在0.1 mg/ml及0.05 mg/ml CNH组均高于胶原对照组,差异具有统计学意义(P<0.01);NC蛋白在0.1 mg/ml及0.05 mg/ml CNH组均高于胶原对照组,差异具有统计学意义(P<0.001,P<0.05);细胞内自发性钙瞬变检测结果显示:培养5天后,0.05 mg/ml和0.1 mg/ml CNH/Col组Ca2+的释放频率及幅度均大于胶原对照组,培养7天后胶原对照组Ca2+释放呈微弱的无规则的电流形式,而0.05 mg/ml和0.1 mg/ml CNH/Col组呈现出显著的节律性,表现为一致性收缩,并且钙释放的幅度更明显;Brd U染色结果显示:第1天,各组间CFs增殖情况结果没有统计学差异;第3天,与胶原对照组相比,0.1 mg/ml CNH-Col组CFs细胞Brd U阳性率小于10%,CFs细胞增殖受到显著抑制,差异具有统计学意义(P<0.001);第7天,与胶原对照组相比,0.1 mg/ml及0.05mg/ml CNH-Col组CFs细胞Brd U阳性率小于5%,CFs细胞增殖受到显著抑制,差异具有统计学意义(P<0.0001);CCK-8实验结果显示:第1天,0.1 mg/ml CNH-Col组吸光度大于胶原对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);第3天,0.1 mg/ml CNH-Col组吸光度小于胶原对照组及0.05mg/ml CNH组,差异具有统计学意义(P<0.0001);第7天,0.1 mg/ml及0.05 mg/ml CNH-Col组吸光度小于胶原对照组,差异具有统计学意义(P<0.0001)。结论:0.05 mg/ml和0.01 mg/ml CNH-Col复合基质材料组均能促进NRVMs细胞电学蛋白Cx-43及力学蛋白NC的表达、细胞间分布,加速NRVMs功能的成熟;与此同时0.05 mg/ml和0.01 mg/ml CNH-Col复合基质材料能抑制CFs的增殖。本研究表明CNH可能成为未来满足CET需要的基质材料。