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在缺少雄性配子基因组的情况直接激活成熟卵子能够形成孤雌囊胚，从这个孤雌囊胚中可以分离得到孤雌胚胎干细胞。孤雌胚胎干细胞的使用避开了伦理问题，可以为再生医学提供种子细胞来源，在细胞移植、组织和器官重建方面具有广阔的应用前景。但是与受精胚来源的胚胎干细胞相比，孤雌胚胎干细胞的发育潜能是非常有限的。造成这一结果的原因之一可能是父源性基因组的缺失。以往的报道证实未生长卵子（新生小鼠卵子）在多个印记基因表达模式上具有精子基因组的特点。本研究首次应用基于“zona-free”的生发泡移植技术构建了包含有未生长卵子和成熟卵子基因组的二倍体孤雌囊胚（NF-pBlastocysts）：首次建立了三株包含有未生长卵子和成熟卵子基因组的孤雌胚胎干细胞系（NF-pES cells）。为了证明NF-pES细胞具有临床治疗价值，我们制造了小鼠肌肉损伤修复模型。结果显示，NF-pES细胞能够分化形成骨骼肌纤维，参与损伤肌肉的修复。作为一个新型的孤雌胚胎干细胞，NF-pES细胞不仅在再生医学领域具有巨大的应用前景而且也提供了一个研究基因印记和器官发育相互关系的体外研究工具。NF-pES细胞的分离成功也为建立人类孤雌胚胎干细胞系提供了一个新的思路。1．胚胎干细胞研究平台的建立——建立在丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞上的胚胎干细胞的分离与鉴定由于进口的丝裂霉素C属国家管制药品，难以购到而且市场报价较贵，所以我们选用国内知名生产商浙江海正药业生产的国药准字H33020786的丝裂霉素。实验结果表明，当丝裂霉素浓度为20μg／ml作用4h或30μg／ml作用2h、4h时，均可有效抑制细胞的分裂而不影响细胞活力。小鼠胎儿成纤维细胞经浓度为30μg／ml的丝裂霉素作用2h后制备饲养层，将7枚体内受精囊胚种植在该饲养层上，从中共获得5个胚胎干细胞株。经鉴定，所有胚胎干细胞株都表达碱性磷酸酶活性，Oct-4和SSEA-1阳性，能够形成具有三个胚层分化能力的畸胎瘤，其中一个细胞株具有生殖系嵌合能力。因此，浙江海正药业生产的丝裂霉素不仅对小鼠胚胎成纤维细胞的生长具有明显的抑制作用，而且支持具有生殖系嵌合能力的ES细胞的分离。国产丝裂霉素价格低廉，大大降低了实验成本，同时本研究也为国产药品在ES细胞研究中的应用提供了试验依据。2．包含有未生长卵子（non-growing oocytes）和成熟卵子（fully grown oocytes）基因组的二倍体孤雌胚胎的构建和孤雌胚胎干细胞（NF-pES cells）系的建立在应用常规生发泡移植技术构建重构二倍体孤雌胚胎过程中，GV期卵子的卵周隙是影响去核效率的一个重要的限制因素。为了解决这一问题，我们发明了一套基于“zona-free”的生发泡移植技术程序。具体做法是在去核操作前将GV期卵子的透明带去除，将所有卵子都放在浓度为5或25μg／ml CCB的操作液内，仅使用一个显微操作臂进行去核，去核率为83.76％。去核GV期卵子经PHA-P与未生长卵子进行粘合，在融合电压为180V、脉冲宽度为20μs和一次电脉冲下融合效率为62.80％。融合的重构卵子在TYH中进行成熟培养，成熟率为70.89％。基于“Zona-free”的生发泡移植技术不仅无需依据卵周隙的大小取舍卵子，减少了切口针对卵子的破坏和提高了去核效率，而且降低了操作难度，易于为初学者所掌握。已有研究证实未生长卵子的基因组表达某些父源性表达的基因而某些母源性表达的基因则被抑制。因此未生长卵子基因组在一定程度上充当了精子基因组的作用。本研究应用基于“zona-free”的生发泡移植技术，使用383枚GV期卵子共获得64枚来自未生长卵子的MⅡ期卵子。将这些MⅡ期卵子的核区移植到体内成熟的昆明小鼠MⅡ期卵子的透明带下，共重构成功56枚。经电融合处理，有51枚发生融合。经SrCl2激活后，获得22枚形成两个原核和排出两个极体的重构胚。将这22枚重构胚继续体外发育共得到13枚囊胚。从这13枚囊胚共分离得到3株NF-pES细胞系。所有NF-pES细胞株均表达碱性磷酸酶活性，SSEA-1和Oct-4阳性。选取其中两株NF-pES细胞系制备嵌合体。嵌合体鼠的心脏、脾、肾和骨髓的流式细胞检验结果显示，一株NF-pES细胞（NF-pES-1）在以上四个脏器的嵌合率分别是15.07％、41.02％、3.55％和11.53％。另外一株NF-pES细胞系（NF-pES-2）是83.36％、68.74％、29.70％和50.44％。对照组受精胚来源的ES细胞在其嵌合鼠的心脏、脾、肾和骨髓的嵌合率分别是77.96％、84.06％、42.49％和52.02％。方差分析显示NF-pES-2在心脏、脾和骨髓上的嵌合率与受精胚来源的ES细胞无显著差异。这一结果表明包含有未生长卵子和成熟卵子基因组的孤雌胚胎干细胞至少在心脏、脾和骨髓方向发育上具有和受精胚来源的胚胎干细胞相当的发育潜能，这为孤雌胚胎干细胞在再生医学领域的应用提供了进一步的证据。3．肌肉损伤修复模型的建立NF-pES细胞来源的畸胎瘤和嵌合体组织中存在大量骨骼肌纤维的事实表明NF-pES细胞具有分化成为骨骼肌纤维的潜能。临床上有一些退行性疾病与肌肉损伤或功能丧失有关如杜氏肌营养不良症等。目前尚无特效药应用于此类疾病的治疗。近年来发现细胞移植是一个非常有效的办法。为了证明NF-pES细胞具有作为移植供体细胞治疗该类疾病的临床应用价值，我们使用心脏毒素处理结合射线照射小鼠的胫骨前肌制造了肌肉损伤模型。首先NF-pES细胞在体外诱导分化成为混合的前体细胞，然后将这些前体细胞移植到小鼠胫骨前肌受损部位。一个月后取材进行免疫组化分析。结果显示NF-pES细胞来源的前体细胞能够嵌合到骨骼肌组织，并且形成部分骨骼肌纤维。我们的实验证明了NF-pES细胞移植具有治疗与骨骼肌损伤或功能丧失有关疾病的应用前景。