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香蕉是华南地区北运和出口的主要水果之一,具有很高的经济价值,但香蕉属典型的呼吸跃变型水果,一旦成熟启动后,果实将迅速衰老劣变。甲硫氨酸亚砜还原酶(Msr)是一类广泛存在于原核与真核生物体内的氧化还原调节蛋白。研究表明,Msr在生物体衰老和抵抗氧化胁迫中发挥重要作用。本文以香蕉果实为材料,在获得Msr基因全长cDNA序列的基础上,分析采后香蕉果实在衰老过程中Msr基因和Msr蛋白的表达特性;利用酵母双杂交和BiFC技术鉴定和证实Msr的靶标蛋白,以期阐明Msr与香蕉衰老的关系,为调控采后香蕉果实成熟衰老进程提供理论依据。主要研究结果如下:
1.利用RT-PCR结合RACE的方法,从香蕉果实中克隆到7个MsrA和2个MsrB基因cDNA全长序列。生物信息学分析结果表明:MaMsrA2、MaMsrA3、MaMsrA4、MaMsrA6、MaMsrA7和MaMsrA10编码的蛋白具有GCFWG催化结构域和DPIRCY保守结构域,而MaMsrA8编码的蛋白的催化结构域为GSFWR,保守结构域为GWPVLRD; MaMsrB1编码的蛋白具有典型的MsrB结构,具有2个保守的锌原子结合结构域CxxC、催化结构域RxCxN和还原结构域SGCGWPAF。MaMsrB2序列与MaMsrB1相似度极高,但还原结构域中无发挥还原作用的Cys。
2.亚细胞定位和转录激活分析表明,MaMsrA3、MaMsrA6、MaMsrA7、MaMsrB1和MaMsrB2定位于细胞质和细胞核,MaMsrA4定位于叶绿体,MaMsrA8定位于内质网,MaMsrA8△N(△N30-248)和MaMsrA10定位于细胞核。转录激活实验表明仅MaMsrB1具有转录激活活性。
3.香蕉果实在衰老中,大分部MaMsr基因的表达迅速增加。高氧处理加速了香蕉果实衰老,显著诱导了MaMsrA8、MaMsrA10和MaMsrB1基因的表达,与活性氧产生及蛋白质氧化呈正相关;MaMsrA6、MaMsrA7以及MaMsrB2的表达也被高氧诱导。这6个基因在响应高氧胁迫所表现的时机和强度上存在差异,表明不同Msr在香蕉果实衰老和氧化胁迫中所发挥的作用不同。Western blot结果表明,MaMsrA8和MaMsrB1蛋白水平的表达与其基因水平的表达结果一致,进一步证实Msr在香蕉果实衰老调控中的作用。
4.酵母双杂交和双分子荧光互补实验表明,MaMsr与MaPOLD1、MaCAT、MaSAHH、MaMmp37、MaNAC2和MaCaM1存在互作,表明MaMsr介导了香蕉果实DNA修复、活性氧清除、细胞甲基化、线粒体蛋白的跨膜运输、基因转录调控、信号转导等重要生理过程,推测MaMsr通过调节这些生理过程调控香蕉果实衰老进程和对氧化胁迫的反应。