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前言侵袭和转移是影响肺癌预后的一个重要恶性行为,目前肿瘤侵袭转移的机制尚不完全清楚,降解细胞外基质（extracellular marix,ECM）组成和基底膜（basementmembrane,BM）是一个重要的步骤,乙酰肝素酶是一种内源性β-葡萄糖苷酸内切酶,能在一些特定位点可切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素侧链,同时释放出一些与硫酸乙酰肝素结合的生长因子（如VEGF、bFGF等）,从而促进细胞侵袭性及肿瘤血管形成。然而目前乙酰肝素酶在肺癌中的作用尚不清楚。本研究我们通过构建靶向人乙酰肝素酶基因短发夹状双链RNA（shRNA）真核表达质粒（pshRNA-Hpa）,探讨RNA干扰（RNAi）抑制肺癌细胞乙酰肝素酶基因的表达及其对肺癌细胞生物学行为的影响。材料与方法1、细胞与裸鼠:人肺巨细胞癌BE1细胞系用含有10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5%CO2的培养箱内培养。BALB/c裸鼠购自中国医学科学院实验动物研究所,在恒温、恒湿、无特定病原体的空气洁净层流架内饲养。2、重组表达质粒pshRNA-Hpa的构建:选取人乙酰肝素酶mRNA中的特异性核苷酸片段为靶标,用siRNA Target Finder软件分析,设计、合成4对siRNA,分别瞬时转染BE1细胞系,从中筛选出1对高效链。用该高效链设计shRNA序列构建重组表达质粒,测序确定序列正确性。3、转染:按照LipofectAMINE2000说明书操作,G418筛选,挑取存活细胞克隆,收集细胞,RT-PCR、Western-blot检测乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达情况,鉴定阳性克隆,挑选获得稳定转染的肺癌细胞株。4、流式细胞仪检测:按照凋亡试剂盒操作说明进行,Annexin-FITC/PI双标后经流式细胞仪检测凋亡发生的比例。5、四甲基偶氮唑蓝（MTT）法:接种各组细胞至96孔培养板,培养24-120h,按照操作说明进行,用酶联免疫检测仪测量各孔在490nm处的吸光值（A490）,根据吸光值绘制细胞增殖曲线。6、Transwell小室检测:接种各组细胞分别至Matrigel包被的含有微孔滤膜的Transwell小室,分别培养24h后,4%多聚甲醇固定,苏木素染色,显微镜观察细胞体外侵袭能力的变化。7、裸鼠接种及HE染色:实验动物分4组,每组5只,动物接种后5周处死动物,分别取各裸鼠的各器官做HE染色,观察肿瘤的转移情况。8、使用SPSS14.0统计软件进行数据处理,以P＜0.05为有统计学意义。结果1、成功构建重组质粒pshRNA-Hpa测序结果表明,重组质粒pshRNA-Hpa编码序列与设计的DNA片段完全一致.表明已成功建立乙酰肝素酶特异的shRNA表达重组载体。2、转染pshRNA-Hpa抑制乙酰肝素酶表达RT-PCR和蛋白质印迹分析显示转染pshRNA-Hpa的BE1细胞乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达明显降低,与未转染对照组、转染空载体组、转染阴性对照shRNA组比较差异均有统计学意义（P值均＜0.01）。而各对照组乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。3、转染pshRNA-Hpa重组体抑制BE1细胞的增殖侵袭能力,诱导细胞凋亡。MTT法测定结果显示,pshRNA-Hpa重组质粒转染的细胞增殖能力明显低于空载体转染组和空白对照组（P值均＜0.01）;而各对照细胞相比无明显差异（P值均＞0.05）。流式细胞仪检测结果显示转染pshRNA-Hpa重组体组细胞凋亡率11.28%±1.05%,明显高于各对照组细胞（P＜0.01）。Transwell侵袭试验结果显示:BE1细胞侵袭相对数为37.0±2.6,转染pshRNA-Hpa重组体细胞侵袭相对数为8.7±3.5。转染pshRNA-Hpa重组体组细胞侵袭细胞数明显低于其他对照组细胞,差异具有显著性（P值均＜0.01）。4、抑制乙酰肝素酶表达可抑制肺癌生长和转移裸鼠体内实验结果表明:pshRNA-Hpa重组质粒可以显著抑制肿瘤生长（抑制率为38.13%）,肿瘤转移能力也明显减弱。结论靶向乙酰肝素酶重组shRNA质粒pshRNA-Hpa能有效抑制BE1细胞中乙酰肝素酶的表达,并能抑制肿瘤的增殖、侵袭、转移,促进细胞的凋亡,RNAi为肺癌的基因治疗提供了一种新策略。