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研究目的
通过试验研究探讨中医从毒痰瘀脾肾虚证候要素出发治疗肝癌的有效性并通过网络药理学初步分析可能的作用机制。本研究从两个层次进行分析:(1)在动物水平，分析毒痰瘀虚方(毒痰瘀虚方)对肝癌细胞生长率、凋亡率及细胞侵袭的影响，评估毒痰瘀虚方抗肝癌的有效性；(2)通过网络药理学分析，获得毒痰瘀虚方治疗肝癌的“成分-靶点”网络，探讨毒痰瘀虚方治疗肝癌的分子通路本质。
研究方法
第一部分：以阴性血清组及索拉菲尼组作为对照，比较毒痰瘀方以及毒痰瘀虚方对小鼠肝癌组织的生长、凋亡、侵袭的作用。统计方法采用SPSS26.0软件分析，所有数据采用均数±标准差((x)±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较釆用LSD检验。所有的统计检验均釆用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。
第二部分：通过OncoDB.HCC、Liverome等数据库检索收集与肝癌发病相关的疾病靶点。以药代动力学ADME参数为筛选标准，在TCMSP中筛选得到毒痰瘀虚方的有效成分；运用PharmMapper获取各有效成分的作用靶点并与肝癌疾病靶点相映射取交集，作为有效成分治疗肝癌的预测靶点，以Excel2016对上述靶点进行整理。利用Cytoscape构建毒痰瘀虚方活性成分-治疗靶点相互作用网络，通过“Tools-NetworkAnalyzer”插件对构建完成的网络进行拓扑结构分析，最后运用ClueGO插件对预测靶点进行生物过程富集分析及KEGG通路富集分析，预测毒痰瘀虚方治疗肝癌过程中相关基因参与调控的生物学过程及涉及的相关信号通路。
研究结果
第一部分：在小鼠实验中，与正常对照组相比，毒痰瘀虚方可显著促进肿瘤组织坏死、提高肿瘤细胞凋亡指数(P＜0.01)，作用仅次于索拉菲尼(P＜0.01)；毒痰瘀虚方亦可显著减少小鼠肿瘤组织内的MVD值(P＜0.01)，与索拉菲尼组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
第二部分：通过对TTD、DrugBank、OncoDB.HCC、Liverome数据库的检索，共得到519个肝癌相关靶点。以“OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4.00”为参数，在TCMSP筛选毒痰瘀虚方有效成分，以TCMID数据库作为补充，最终获得159个活性成分，运用PharmMapper获取各活性成分的潜在靶点，并与肝癌靶点进行映射，经整理获取146个毒痰瘀虚方治疗肝癌预测靶点。以P≤0.001对预测靶点进行GO生物过程分析及KEGG通路富集分析发现，146个肝癌预测靶点主要涉及44个生物过程，包括细胞迁移的正调控、蛋白酪氨酸激酶活性、ERK1和ERK2级联、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇介导的信号传导、对皮质类固醇的反应、上皮细胞增殖的调控、对糖皮质激素的反应、磷脂酶活性的调节、上皮细胞迁移、内皮细胞迁移的正调控、缺乏配体的外源性凋亡信号通路等。参与癌症信号通路、癌症中的蛋白多糖、癌症的中心碳代谢、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞凋亡、细胞周期等30条信号通路的调节。
结论
毒痰瘀虚方可显著促进小鼠肝癌组织坏死，诱导肝癌细胞凋亡，降低肝癌组织MVD值。对毒痰瘀虚方的网络药理学分析发现，该复方可能通过癌症信号通路、癌症中的蛋白多糖、癌症的中心碳代谢、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、乙型肝炎、Ras信号通路、肿瘤中的MicroRNAs、雌激素信号通路、HIF-1信号通路、血管内皮生长因子信号通路等发挥抗肝癌效应。分析结果表明毒痰瘀虚方可从多靶点、多角度、多水平发挥治疗肝癌的作用，此研究为今后毒痰瘀虚方进一步的实验研究提供了方向。
通过试验研究探讨中医从毒痰瘀脾肾虚证候要素出发治疗肝癌的有效性并通过网络药理学初步分析可能的作用机制。本研究从两个层次进行分析:(1)在动物水平，分析毒痰瘀虚方(毒痰瘀虚方)对肝癌细胞生长率、凋亡率及细胞侵袭的影响，评估毒痰瘀虚方抗肝癌的有效性；(2)通过网络药理学分析，获得毒痰瘀虚方治疗肝癌的“成分-靶点”网络，探讨毒痰瘀虚方治疗肝癌的分子通路本质。
研究方法
第一部分：以阴性血清组及索拉菲尼组作为对照，比较毒痰瘀方以及毒痰瘀虚方对小鼠肝癌组织的生长、凋亡、侵袭的作用。统计方法采用SPSS26.0软件分析，所有数据采用均数±标准差((x)±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较釆用LSD检验。所有的统计检验均釆用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。
第二部分：通过OncoDB.HCC、Liverome等数据库检索收集与肝癌发病相关的疾病靶点。以药代动力学ADME参数为筛选标准，在TCMSP中筛选得到毒痰瘀虚方的有效成分；运用PharmMapper获取各有效成分的作用靶点并与肝癌疾病靶点相映射取交集，作为有效成分治疗肝癌的预测靶点，以Excel2016对上述靶点进行整理。利用Cytoscape构建毒痰瘀虚方活性成分-治疗靶点相互作用网络，通过“Tools-NetworkAnalyzer”插件对构建完成的网络进行拓扑结构分析，最后运用ClueGO插件对预测靶点进行生物过程富集分析及KEGG通路富集分析，预测毒痰瘀虚方治疗肝癌过程中相关基因参与调控的生物学过程及涉及的相关信号通路。
研究结果
第一部分：在小鼠实验中，与正常对照组相比，毒痰瘀虚方可显著促进肿瘤组织坏死、提高肿瘤细胞凋亡指数(P＜0.01)，作用仅次于索拉菲尼(P＜0.01)；毒痰瘀虚方亦可显著减少小鼠肿瘤组织内的MVD值(P＜0.01)，与索拉菲尼组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
第二部分：通过对TTD、DrugBank、OncoDB.HCC、Liverome数据库的检索，共得到519个肝癌相关靶点。以“OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4.00”为参数，在TCMSP筛选毒痰瘀虚方有效成分，以TCMID数据库作为补充，最终获得159个活性成分，运用PharmMapper获取各活性成分的潜在靶点，并与肝癌靶点进行映射，经整理获取146个毒痰瘀虚方治疗肝癌预测靶点。以P≤0.001对预测靶点进行GO生物过程分析及KEGG通路富集分析发现，146个肝癌预测靶点主要涉及44个生物过程，包括细胞迁移的正调控、蛋白酪氨酸激酶活性、ERK1和ERK2级联、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇介导的信号传导、对皮质类固醇的反应、上皮细胞增殖的调控、对糖皮质激素的反应、磷脂酶活性的调节、上皮细胞迁移、内皮细胞迁移的正调控、缺乏配体的外源性凋亡信号通路等。参与癌症信号通路、癌症中的蛋白多糖、癌症的中心碳代谢、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞凋亡、细胞周期等30条信号通路的调节。
结论
毒痰瘀虚方可显著促进小鼠肝癌组织坏死，诱导肝癌细胞凋亡，降低肝癌组织MVD值。对毒痰瘀虚方的网络药理学分析发现，该复方可能通过癌症信号通路、癌症中的蛋白多糖、癌症的中心碳代谢、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、乙型肝炎、Ras信号通路、肿瘤中的MicroRNAs、雌激素信号通路、HIF-1信号通路、血管内皮生长因子信号通路等发挥抗肝癌效应。分析结果表明毒痰瘀虚方可从多靶点、多角度、多水平发挥治疗肝癌的作用，此研究为今后毒痰瘀虚方进一步的实验研究提供了方向。