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石英晶体微天平(QCM)作为一种质量型生物传感器,具有免标记、样品用量少、实时动态等特点,在分子识别与生物分子相互作用研究中发挥重要作用。本论文针对QCM研究中存在的一些问题,包括如何进一步提高QCM传感响应,如何深入发掘其免标记与实时动态的优势,以进行快速分析测定,并获取相互作用与生物分子结构相关性的信息等,开展了QCM新方法与新应用研究,主要进展如下:
发展了基于原位生长纳米金的肝素QCM生物传感器研究抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)灵敏传感响应的新方法。以小颗粒纳米金为种子,将其自组装于QCM电极表面,以FIA-QCM系统实时监测了纳米金在QCM晶片上的原位生长情况。研究了以不同生长时间纳米金所构建的肝素传感器对ATⅢ的传感响应,结果表明纳米金原位生长5 min,粒径达到30 nm时,传感器具有最大的响应,其频降值为114.2 Hz。与直接修饰大粒径纳米金相比,原位生长纳米金所构建的传感器比表面积更大,配基固定量更多,对ATⅢ具有更灵敏的传感响应,因此纳米金原位生长是提高QCM检测灵敏度的一个简捷而有效的新方法。
发展了胆红素介导的人血清白蛋白QCM生物传感器检测药物作用位点的新方法。以最重要的药物结合蛋白-人血清白蛋白(HSA)为研究对象,构建了HSA生物传感器,依据胆红素与HSA第一药物作用位点具有强相互作用的特性,研究了胆红素介导的HSA-药物相互作用,通过药物与HSA的动态相互作用曲线,确定药物在HSA上的作用位点。结果表明,对于胆红素预结合的人血清白蛋白QCM传感器,当注入布洛芬、酮洛芬和氟比洛芬时,频率分别继续下降了6 Hz、4 Hz及5 Hz,传感曲线及频降值与它们单独作用时几乎一致,说明药物与HSA的结合是独立的,胆红素的预结合不对其产生影响,证明它们是第二作用位点药物。当注入水杨酸镁和胆影酸时,频率先保持不变,然后迅速下降4 Hz及升高4 Hz,表明与胆红素发生了竞争性结合,置换了部分胆红素,证明它们是第一作用位点药物。此方法具有免标记、灵敏、快速、准确的特点。
成功构建了胰蛋白酶抑制剂生物传感器,研究了与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶的动态相互作用,并尝试进行了动态相互作用与蛋白酶结构相关性的研究。分别得到了三种蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂的结合速率常数、解离速率常数及平衡结合常数,研究表明其动态和静态常数与蛋白酶的构象密切相关。与胰凝乳蛋白酶相比,胰蛋白酶结合速率常数及解离速率常数均较小,这是因为其底物结合部位S1口袋较深,抑制剂较难进入结合且难以解离逸出。胃蛋白酶由于其Asp-Ser-Cys序列与胰蛋白酶活性部位相同,其结合速率常数相近,但因为其暴露在蛋白表面极易解离,因此其解离速率常数较大。
构建了QCM细胞培养传感系统,初步研究了肝癌细胞BEL7402在石英晶片表面的贴壁及生长行为。结果表明裸金表面基本适合肝癌细胞的贴壁及生长;荧光共聚焦图像显示,细胞在石英晶片表面贴壁状况良好,已基本得到铺展。证明所构建的系统可以进行细胞贴壁与生长的动态监测研究,此体系有望用于抑制肝癌细胞生长药物的快速筛选。