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高效、低毒生物农药开发是目前实现农业可持续发展的重要手段之一。枯草芽孢杆菌JA是实验室自行从土壤中分离的一株植物病原菌拮抗微生物,该菌株表现出广谱的抑菌活性。本文系统研究了枯草芽孢杆菌JA对植物病原菌的抑菌作用;分离纯化并鉴定了JA产生的各种类型的抗生素;对JA产生的挥发性物质的成分和抑菌机制进行了研究;采用不同诱变方式诱变出发菌株JA,选育脂肽类抗生素高产突变株;研究了高产菌株液体发酵和固体发酵的生产工艺,优化发酵参数,提高产物产率。全文内容分为以下几个部分。
1.研究了枯草芽孢杆菌JA对部分植物病原菌的抑菌效应。JA产生的抗生素能够强烈抑制小麦赤霉病(Fusarium graminearum)、水稻纹枯病(Rhizoctoniasolani)、枯萎病(Fusarium oxysporum)等多种植物病原菌以及灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)等水果霉腐菌的生长,在防治植物病害和水果腐烂方面具有重要的应用价值,表现出广谱抗真菌作用。对JA抑菌机制的深入研究表明,JA产生的小分子挥发性物质,能够显著抑制B. cinerea孢子的萌发和菌丝的生长,同时对其他丝状真菌也有很好的抑制作用。脂肽类抗生素和挥发性抑菌物质的作用是JA具有抗菌活性的重要原因。
2.对枯草芽孢杆菌JA活性产物进行了分离纯化和结构分析。通过酸沉淀、有机溶剂提取、反相HPLC分离和电喷雾质谱(ESI/MS)分析,表明JA产生的抗生素分别属于surfactin,iturin和fengycin家族。研究了脂肽类抗生素的等度HPLC和梯度HPLC分离。结果表明,等度HPLC方法能够分离到surfactin和较纯的iturin,而难以将fengycin洗脱下来;在梯度HPLC方法中,随着乙腈浓度的逐渐增加,能够将fengycin沈脱下来。研究利用ESI/MS方法先测定活性洗脱峰中各个化合物的分子量,再对一级质谱中的离子峰进行碰撞诱导解离(CID)分析,根据特征离子碎片推断出各个化合物分子的结构。本文提供了一种从枯草芽孢杆菌发酵液中分离和鉴定脂肽类抗生素的有效方法。
3.对枯草芽孢杆菌JA挥发性抑菌物质的研究。JA挥发性物质能够抑制B。cinerea菌丝管的延伸。处理30 h后,部分菌丝管中的原生质回缩,菌丝体产生中空现象,导致生长停滞和死亡。对JA挥发性物质进行收集和气质联用(GC/MS)分析,鉴定了14种挥发性物质,其中已知2-乙基-1-己醇、2-壬酮、2,4-bis(2-甲基丙基)-苯酚和4-羟基苯甲醛4种化合物具有抗真菌作用。
4.为了提高枯草芽孢杆菌JA脂肽类抗生素的产量,利用离子注入和大气压等离子体复合诱变方法选育高产突变菌株,确定了等离子体辐照时间和存活率的关系曲线。经过多轮诱变、筛选,最终选育出突变株B06,其脂肽类抗生素产量较出发菌株提高了32%。
5.突变株B06的液体深层发酵(SmF)和固体发酵(SSF)生产工艺研究。SmF培养基和发酵条件优化结果为,最佳碳源为乳糖;最佳氮源为硝酸铵和玉米浆粉复合物;微量元素浓度为,Zn2+0.06 mmol/L、Mn2+0.02 mmol/L;最适pH值在6.0~6.5之间;种子龄为14 h。利用优化培养基和发酵条件,在3.7 L发酵罐中,控制通气量150 l/h、搅拌转速300 r/min,温度30℃,发酵60 h,脂肽类抗生素产量达到3.1 g/L,较优化前产量(0.8 g/L)有大幅度的提高。
在SSF发酵过程中,以麸皮为固体基质,以葡萄糖、蛋白胨为辅助碳氮源时,发酵提取物的抑菌活性最高。优化后培养基组成为250 mL三角瓶中加入麸皮10 g,其他辅助营养元素:葡萄糖0.6 g,蛋白胨0.4 g,1 M KH2PO4100μL,1 M MgSO4200μL,加水量70%,接种量3 mL。在30℃条件下发酵5 d,脂肽抗生素粗提物达到88 g/kg(湿基)。