球头三型孢菌产多元醇代谢调控研究

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赤藓糖醇是一种低热值、耐受量高、且可以有效防治龋齿的四碳糖醇,因其具备多种优良特性,它已经成为国际认可的食品添加剂。在发酵过程中,球头三型孢菌(Trichosporonoides oedocephalis ATCC 16958)会产生赤藓糖醇和甘油等醇类物质,通过改变发酵培养过程的营养物质、无机盐等的添加,可能影响代谢途径关键酶的活性,从而改变菌株发酵生产不同多元醇的量。为此,本文研究主要围绕金属离子盐添加、金属离子盐与碳源葡萄糖的协同补料发酵、以及表面活性剂(两性离子)等的添加来研究球头三型孢菌的代谢调控,旨在探明相关的代谢调控机制和提高多元醇(主要是赤藓糖醇)的产量,本文研究的主要内容如下:首先,系统研究了四种金属离子盐CuSO4·5H2O,Ni(NO32·6H2O,MnSO4·H2O,Al2(SO43·18H2O对球头三型孢菌多元醇产量的影响。揺瓶培养120 h后,与对照相比,在30 mg/L CuSO4·5H2O作用下的赤藓糖醇含量增加了86.40%,副产物甘油减少了31.23%。此外,在5-L发酵罐中分批培养108 h后,补充30 mg/L CuSO4·5H2O下的赤藓糖醇产量达到44.27 g/L,比对照增加了27.10%。进一步研究表明,培养60 h后,与对照相比,在发酵罐中添加30 mg/L CuSO4·5H2O的赤藓糖还原酶(ER)活性显著增加,而大多数发酵时间里3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)活性都在降低。此外,与对照细胞相比,用Cu2+处理的球头三型孢菌细胞中的NADPH/NADP比例略低。其次,在铜离子研究的基础上,为考察不同发酵方式下的多元醇生产状况,我们在5-L发酵罐中先采用不同浓度的葡萄糖进行分批发酵,然后用优化的葡萄糖浓度并添加CuSO4·5H2O进行发酵探索。结果表明,初始葡萄糖浓度为300 g/L的赤藓糖醇产量最大为44.52 g/L,其体积生产速率为0.371 g/(L·h)、产率为0.167 g/g。在此浓度葡萄糖的基础上添加30 mg/L的CuSO4·5H2O后,赤藓糖醇产量达到49.62 g/L,提高了11.5%。进一步控制总糖浓度为300 g/L,且初始浓度为200 g/L,分别进行单独补糖和协同补糖与铜离子的补料发酵,结果赤藓糖醇产量分别为47.25 g/L和55.31g/L,比初始300 g/L的葡萄糖分批发酵分别提高了6.1%和24.2%。特别地,协同补糖与CuSO4·5H2O后,赤藓糖还原酶的活性在84 h达到最大,为0.152 U/mg protein,比单独补糖时提高了18.8%;通过铜离子盐和葡萄糖的协同补料发酵可显著提高赤藓糖醇的产量,最终使赤藓糖醇生产速率达到0.461 g/(L·h)。最后,我们又考察了不同种类的表面活性剂对球头三型孢菌发酵产多元醇的影响。揺瓶发酵120 h后,添加0.5 g/L甜菜碱所对应的赤藓糖醇产量最大,为37.16 g/L,比对照提高了50.38%。通过对酶活的分析,发现发酵48 h后,0.5 g/L甜菜碱(0.211U/mg protein)作用下的赤藓糖还原酶活性略高于对照(0.192 U/mg protein),且两者都在此时达到最大值;此外,在整个发酵过程中两者的ER活性大小没较大差别。进一步用扫描电子显微镜观察后发现,发酵培养96和120 h后,对照组细胞破损严重,而0.5 g/L甜菜碱作用下的细胞结构仍然较完整。
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