RNA解螺旋酶普遍存在于生物体中,能够通过结合水解NTPs获得能量,进而实现双链核酸解旋或核酸-蛋白质复合体结构重塑。DExH/D-box RNA解螺旋酶作为RNA解螺旋酶中最大的家族成员在各种涉及RNA的细胞进程中发挥重要作用,包括mRNA前体剪切、mRNA输出、核糖体生成及翻译起始、RNA降解等。众所周知,RNA解螺旋酶的解螺旋特征是其重塑RNA蛋白复合体,以及发挥生物生化功能的重要基础。目前对DExH/D-box RNA解螺旋酶解旋机制的研究表明,DExH/D-box RNA解螺旋酶主要以两大亚家族DEAD-box解螺旋酶和DExH-box解螺旋酶为代表,分别以“定向移位解螺旋”机制和“局部扰动解螺旋”机制发挥解旋活性。RNA解螺旋A简称RHA,是DExH-box解螺旋酶家族的典型代表。研究表明,RHA具有底物3’尾巴依赖的解螺旋极性,能够利用水解NTPs释放的能量,在底物核酸链上以3’到5’方向快速、连续、定向地移位来发挥解旋活性。Ded1p是DEAD-box解螺旋酶家族的典型代表。与RHA不同,已报导的生化研究表明Ded1p不具有解螺旋极性,它通过直接结合到底物的双螺旋区域、并打开结合部位有限数量的碱基对来催化解旋的发生。虽然RHA与Ded1p部分解旋特征已被揭示,但它们识别并解旋底物核酸结构的具体物理机制仍不是很清楚。另外,DExH/D-box RNA解旋螺旋酶家族两种典型性解旋方式之间异同和相关性也值得深入研究与探讨。本文以全长的RHA和Ded1p为研究对象,分别利用生物化学手段和单分子荧光共振能量转移技术探究了两种解螺旋酶解旋双链核酸底物的具体机制。一、体外表达纯化RHA重组蛋白本试验先后选用悬浮培养的哺乳动物细胞293f和昆虫细胞sf9作为表达全长RHA蛋白的宿主细胞,探究全长RHA蛋白在两种细胞中表达情况。结果如下:1.全长RHA蛋白都能够在两种细胞中表达。对于293f细胞,胞内表达时于转染后48小时出现较高量表达,分泌表达时于转染后120小时出现表达量峰值。2.经Ni2+-NTA-agarose亲和层析和Capto DEAE sepharose离子交换层析,最终获得了纯净的全长RHA重组蛋白,但sf9细胞表达量显著高于293f细胞。二、RHA解旋机制的研究本试验利用生物化学手段探究了 RHA与一系列修饰后双链核酸底物的解旋反应。结果表明:1.RHA以3’到5’方向沿着具有共价连接连续性的RNA链,而非DNA链进行有效移位。双链RNA底物的磷酸核糖骨架破坏,尤其是负载链磷酸核糖骨架的破坏,会显著抑制RHA的解旋作用。2.RHA需要3’负载链尾巴上、直接或间接连接到双链区域的RNA成分来介导有效解旋,并且RHA的解旋效率随该RNA组分长度的增长而提高。3.底物负载链3’尾巴上与双链区域直接连接的结合区域在RHA解旋反应中也起到了至关重要的作用,当RNA组分处于该位置时,即使仅有4 nt也能显著提高RHA的解旋效率。最后,本章提出了一个揭示RHA沿着底物磷酸核糖骨架移位的解旋机制。三、RHA与Ded1p解旋机制的比较研究本试验利用smFRET检测技术实现了 Ded1p解旋dsRNA底物过程的实时观测,从分子水上揭示了 Ded1p的解旋动力学特征。结果表明:1.双链RNA底物解旋发生前,会受到来自Ded1p的循环扰动作用,表现出的FRET值与打开6或10个碱基对的FRET值一致,并且扰动发生的频率不具有ATP浓度、双链长度以及单链尾巴极性依赖。2.约75%的Ded1p以一步解旋的方式进行解旋,剩下的则以两步解旋的方式进行解旋。基于上述结果,本章提出了一个包含两条解旋路径的Ded1p解旋模型,其中一步解旋路径符合传统认知的“局部扰动解旋模型”。最后,对RHA与Ded1p解旋机制的比较发现:RHA与Ded1p一样,都以ATP依赖的方式打开dsRNA底物;ssRNA尾巴是催化RHA解旋的必要前提,却不是Ded1p发挥解旋活性的必要条件;RHA通过结合到ssRNA尾巴上触发解旋起始,而Ded1p则直接结合到dsRNA的双螺旋区域触发解旋起始。另外,虽然RHA为典型的极性解螺旋酶,但它在定向移位解旋过程中表现出了同Ded1p相似的解旋特征,即可以利用与dsRNA双螺旋区域不直接共价相连的ssRNA尾巴催化解旋。