乙肝疫苗评价技术及其应用研究

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通常MHC I类四聚体被用于定量分析表位特异的CD8+T细胞。MHC I类四聚体是由4个MHC I类复合物和一个带有荧光标的亲和素分子组成的。其中每个MHC I类复合物是由分别表达、纯化的MHC分子的重链和β2微球蛋白与合成的表位肽在折叠缓冲液中共折叠所形成的。这种方法势必会形成较多的多聚物和自身折叠产物,而且同时纯化两种单体是很费时的。为了解决这些问题,在本研究中,我们将串联设计的人/鼠嵌合MHC分子的重链(HLA-A2α1, HLA-A2α2,MHC-H2Dα3)与β2微球蛋白克隆到pET17b载体上,并表达为融合蛋白。将重组的融合蛋白与HLA-A2限制性表位肽两者共折叠形成人/鼠嵌合MHC I类复合物。这样就会提高产量,也可以节省大量时间。此外,我们还采用了凝胶迟滞的方法来检测人/鼠嵌合MHC I类复合物生物素化的效率。我们将最终形成的人/鼠嵌合四聚体用于体外定量检测HLA-A2转基因鼠上所产生的HLA-A2限制性细胞免疫水平。由于缺少合适的动物模型,在体内对人乙肝疫苗免疫原性的临床前评价一直受到了制约。在本项研究中,我们构建了能够同时表达HBV和HLA两种基因的HBV/HLA-A2.1双转基因小鼠。此双转基因鼠不仅表现出对HBV各种抗原的耐受,而且能够有效地递呈HLA-A2限制性的抗原表位。我们用HLA-A2限制性HBc或HBs的表位疫苗免疫此双转基因小鼠,借助CTL实验、酶联免疫斑点实验和四聚体染色的手段证明其能够被有效的诱导出针对HLA-A2限制性HBc和HBs特异性的免疫应答。总之,我们构建的有生物活性的人/鼠嵌合四聚体以及HBV/HLA-A2.1双转基因鼠国内外均未见报道。人/鼠嵌合四聚体能恰当的定量反映HLA-A2限制性细胞免疫水平。同时,HBV/HLA-A2.1双转基因小鼠能够在多方面评价人乙肝疫苗的免疫原性:抗体的产生、γ干扰素的分泌水平、免疫小鼠的特异性CTL活性和有效降低体内抗原水平。这些结果也证明了HBV/HLA-A2.1双转基因小鼠作为评价人乙肝病毒疫苗免疫原性动物模型的可用性。
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