应用SNP分型技术对汉坦病毒宿主动物遗传特征的研究

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qinchuanhedian
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目的:了解河北省肾综合征出血热疫源地鼠种构成、带毒率及宿主动物所携带汉坦病毒与遗传特性间的关系,指导本病的预防和控制。   方法:   1 疫源地调查,夹夜法捕鼠,无菌取鼠肺;   2 用冷冻切片机切鼠肺,冷丙酮固定,间接免疫荧光法筛选汉坦病毒阳性鼠肺;   3 从阳性和阴性鼠肺中提取总RNA;   4 根据文献以及GENBANK 中已知的SNP 位点查找特异性引物,用等位基因特异性引物聚合酶链反应(ASP-PCR)进行扩增,并进行电泳和观察结果;   5 根据电泳结果,对SNP 位点进行分型,分析基因多态性特征。通过病例对照研究(Case-control Study)分析HV 宿主动物单核苷酸多态性与宿主动物HV 携带状态的关系。   结果:   1 鼠间疫情资料显示褐家鼠占总捕获鼠种的64.90[%],是河北省的优势鼠种。河北省居民区鼠种主要为褐家鼠和小家鼠,分别占居民区总捕获鼠种的73.38[%]和24.10[%];野外鼠种主要为褐家鼠、大仓鼠和小家鼠,分别占野外总捕获鼠种的54.72[%]、20.75[%]和13.21[%]。河北省居民区鼠密度为2.16[%],高于野外鼠密度(0.53[%])。   2 将527份鼠肺冷冻切片,冷丙酮固定后用间接免疫荧光法检测,阳性鼠肺共17份,阳性率为3.23[%]。提示我省肾综合征出血热疫源地鼠带毒率较低,带毒鼠为宅区褐家鼠,野外及其它鼠种未检出。   3 rs8153609 位点等位基因和基因型频率在各研究组中的分布:根据Hardy-Weinberg 平衡公式检验,携带HV与未携带HV 两组标本中均存在C、T 两种等位基因,推算出CC、CT、TT 三种基因型的理论频数(预期值),结果显示χ2=1.339,p=0.512>0.05,说明实际基因型频率与期望基因型频率的差异没有统计学意义,其分布符合Hardy-Weinberg 平衡,有较好的群体代表性。   Rs8153609 位点基因型与等位基因频率的比较结果显示,HV 携带组和未携带组rs8153609 位点CC基因型频率分别为0[%]和28.13[%],TT基因型频率分别为21.74[%]和25.00[%],CT基因型频率分别为78.26[%]和46.87[%],CC、TT基因型频率HV 携带组低于未携带组,CT基因型频率HV 携带组明显高于未携带组(χ2=8.729,P=0.009<0.05),基因型频率差异有显著性。提示rs8153609 位点的基因型可能与HV 感染相关,CT基因型的存在可能会增加宿主动物感染HV的机会。HV 携带组和未携带组rs8153609 位点C 等位基因频率分别为39.13[%]和51.56[%],T 等位基因频率分别为60.87[%]和48.44[%],统计学分析没有显著性差异(χ2=1.663,P=0.197>0.05)。Rs8153609 位点C和T 等位基因频率在HV 携带组和未携带组中未发现差别。   Rs8153609 位点不同基因型与HV 携带状态的比较结果显示,CT基因型标本HV的感染率为54.55[%],CC基因型及TT基因型标本HV的感染率为22.73[%],CT基因型标本HV的感染率明显高于CC基因型及TT基因型标本HV的感染率(χ2=5.493,P=0.019<0.05)。CT基因型标本感染HV的危险性是CC基因型及TT基因型标本感染HV的4.08 倍(OR=4.080,95[%]CI为1.21 7~13.680)。   进一步分析不同地域宿主动物rs8153609 位点CT基因型频率分布是否存在差别,东北部地区(张家口、承德、唐山、秦皇岛)和中南部地区(保定、石家庄、沧州、邯郸)rs8153609 位点CT基因型频率分别为64.29[%]和55.56[%],东北部地区CT基因型频率较高,但统计学分析没有显著性差异(χ2=0.437,P=0.509>0.05),因此本次实验中,尚没有发现不同地域宿主动物rs8153609 位点CT基因型频率分布有差别。   4 rs8174936 位点等位基因频率及基因型频率在各研究组中的分布:携带与未携带HV 两组标本中均存在C、T 两种等位基因和CC、CT、TT 三种基因型,将各实际观察值代入Hardy-Weinberg 平衡公式进行检验结果显示:χ2=3.988,p=0.136;即p 值大于0.05,说明实际基因型频率与期望基因型频率的差异没有统计学意义,其分布符合Hardy-Weinberg平衡,具有群体代表性。   HV 携带组和未携带组rs8174936 位点CC基因型频率分别为21.74[%]和24.24[%],TT基因型频率分别为13.04[%]和6.06[%],CT基因型频率分别为65.22[%]和69.70[%],经统计学分析(χ2=0.818,P=0.761>0.05),基因型频率无显著性差异。Rs8174936 位点的三种基因型频率在HV 携带组和未携带组中的分布无差异。HV 携带组和未携带组rs8174936 位点C 等位基因频率分别为52.17[%]和59.09[%],T 等位基因频率分别为47.83[%]和40.91[%],统计学分析没有显著性差异(χ2=0.527,P=0.468>0.05)。即rs8174936 位点的C和T 等位基因频率在HV 携带组和未携带组中的分布没有差异。   Rs8174936 位点不同基因型与HV 携带状态的比较结果显示,CC基因型及CT基因型标本HV的感染率为39.22[%],TT基因型标本HV的感染率为60.00[%],虽然TT基因型标本HV的感染率略高于CC基因型及CT基因型标本HV的感染率,但统计学分析无显著性差异(P=0.392>0.05,Fishers Exact Test)。本次试验中还不能认为该位点与宿主动物HV携带状态相关。   结论:   1 褐家鼠、小家鼠是河北省居民区主要鼠种,褐家鼠、大仓鼠和小家鼠是野外主要鼠种。褐家鼠是河北省的优势鼠种,并且是肾综合征出血热的主要传染源。   2 rs8153609 位点的基因多态性可能与褐家鼠HV 携带状态相关,CT基因型可能会增加褐家鼠感染HV的危险,但其地域分布没有显著差别。   3 rs8174936 位点的基因多态性可能与褐家鼠HV 携带状态无相关性。   4 TNF-α基因可能与褐家鼠感染HV 存在相关性。
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