背景和目的肺癌是目前发病率和死亡率增长最快、对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一,是目前肿瘤相关死亡的头号杀手,每年因肺癌死亡的人数多于乳腺癌、肠癌和前列腺癌死亡人数的总和;在我国,肺癌已取代肝癌成为首位恶性肿瘤死亡原因。肺癌主要有两种组织类型,即小细胞型肺癌和非小细胞型肺癌(Non small cell lung cancer,NSCLC)。其中NSCLC占所有肺癌患者的80%左右,肺腺癌约占NSCLC的25%左右且比例在逐年增加。而大多数患者在就诊时就是局部晚期(Ⅲ期)或转移(Ⅳ期),只有近25%的NSCLC患者被诊断为早期NSCLC,有手术治愈的可能,但结局仍难预料。NSCLC最常见的治疗方法有放化疗(CRT)和三联治疗,即包括放化疗及随后的手术切除治疗。由于不同病理条件下晚期非小细胞肺癌的广泛异质性,晚期NSCLC的治疗仍是一个困难且有争议的领域。总体而言,通常采用的CRT并行方式治疗中位生存期达到17-20个月,3年生存率23%至27%。Ⅳ期NSCLC患者的预后通常更差,中位生存期仅6个月。因此肺癌转移是导致肺癌患者治疗失败和死亡的最主要原因。肿瘤转移是恶性肿瘤的主要特征之一,是导致恶性肿瘤患者死亡的首要因素。转移是肿瘤发展的一个重要阶段,且多数患者死于肿瘤转移。阐明恶性肿瘤侵袭和转移的关键机制,建立相应的阻遏肿瘤转移途径是根治肿瘤的希望所在。肺癌侵袭转移是一个多因素调控、多步骤、多阶段、连续复杂的生物学过程,上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transitions,EMT)被认为是上皮细胞来源的恶性肿瘤发生转移早期必经的关键事件,EMT这一概念的提出使人们更加深刻的理解了肿瘤侵袭转移机制。EMT是发生于肿瘤侵袭和转移早期的一个重要事件,在恶性肿瘤原位侵袭和远处转移中发挥十分关键的作用;对肿瘤细胞中的EMT启动、维持及逆转的分子调节机制进行深入系统地研究,有利于阐明恶性肿瘤细胞中调控EMT过程发生的分子机制和揭示其诱因,鉴定调控EMT过程的关键分子,这也将为临床上设计出通过遏制或逆转肿瘤细胞的EMT并进而阻断或逆转肿瘤的侵袭转移过程的全新的治疗方案提供可靠理论基础和有力证据,新的治疗方案的制定可实现早期干预和治疗恶性肿瘤转移。但目前,人们对肿瘤中(包括肺癌)细胞EMT、侵袭和转移的分子机制仍然知之甚少,而对肿瘤EMT、侵袭和转移机制的研究将有助于深入了解转移过程,并可以筛选到有意义的治疗靶标,为临床诊断和治疗奠定基础。miRNA是一类非编码的小分子RNA,它通过一定的方式可参与机体多种生理和病理过程;miRNA也参与了肿瘤细胞在EMT和肿瘤侵袭转移过程中的调控。miR-17-92基因簇是一个典型的多功能基因,参与了多种病理生理过程;该基因簇在多种肿瘤(包括肺癌)组织中异常高表达,具有促进肿瘤的发生、肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成等功能,被认为是癌性微小RNA(oncomiR)。miR-17-92基因簇由6个miRN As构成,根据种子序列可将他们分为四个家族,其中包括miR-19家族(含miR-19a和miR-19b-1)。miR-17-92基因簇过表达可在转基因小鼠上促进c-Myc诱导的淋巴瘤发生,miR-19已被证实是miR-17-92基因簇中发挥致瘤作用的关键成分;miR-19a在晚期NSCLC组织上的表达水平远高于早期NSCLC组织;在基于c-Myc转基因小鼠建立的B细胞淋巴瘤小鼠模型上,Em-myc/19b-1实验组淋巴瘤具有高度侵袭性(与Em-myc组比),淋巴瘤细胞可侵犯入胸腺、骨髓、肝和肺等器官;高转移性人骨肉瘤细胞系上miR-19a表达水平显著高于低转移性骨肉瘤细胞系。这些证据提示,miR-19在肿瘤侵袭转移过程中可能发挥一定作用,我们的前期研究也支持了这一观点,但仍需充分的体内外实验证据给予证实。有研究表明,在肺癌细胞上过表达miR-17-92可促进细胞的增殖,那么,miR-19在miR-17-92基因簇促进肺癌增殖过程中究竟扮演何种角色,值得进一步研究。鉴于本课题组成员在前期研究中发现miR-19在肿瘤侵袭转移过程及在肺癌增殖方面表现出来明显作用,我们深入开展了本研究。方法第一章miR-19对肺癌细胞EMT、迁移及侵袭的调控作用1.提取肺癌细胞总RNA,按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书,逆转录成cDNA后,qRT-PCR检测miR-19的mRNA表达水平。2.质粒提取,NaAC-乙醇沉淀法纯化质粒。3.稳定细胞株建立穿梭载体PPAX2和包装载体PMD2G与表达质粒共转染293T细胞,生产慢病毒,感染肺癌细胞,建立稳定携带miR-19的肺癌细胞株。4.qRT-PCR和Western blot检测EMT相关基因蛋白水平表达。5.人类全基因组表达谱基因芯片分析基因表达谱。6.总RNA提取、逆转录、qRT-PCR验证基因芯片结果。7.Transwell迁移试验检测细胞迁移能力。8.细胞粘附试验检测细胞粘附能力。9.F-actin鬼笔环肽染色试验及激光共聚焦显微镜观察细胞的骨架变化。10.扫描电子显微镜观察细胞形态变化。11.MTT法绘制细胞的生长曲线;平板克隆形成实验检测细胞增殖情况。12.流式细胞仪进行细胞周期检测。13.裸鼠皮下成瘤实验检测细胞在体生长情况。14.免疫组织化学染色和Western blot检测皮下成瘤组织中EMT相关基因表达变化15.TNF-α诱导法检测细胞凋亡情况及qRT-PCR验证凋亡基因表达变化。16.统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计分析。qRT-PCR各肺癌细胞株2-△△Ct的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA);两组的qRT-PCR分析采用单样本t检验;细胞周期、平板克隆及transwell小室迁移实验两组间比较采用两独立样本t检验;EDTA细胞粘附实验、过表达miR-19的A549细胞皮下成瘤生长情况的分析采用两个重复因素的方差分析;细胞周期分布的分析、MTT法检测细胞增殖能力及caspase-8和caspase-3活性的分析采用析因设计资料的方差分析。每个实验至少独立重复3次,P<0.05则认为有统计学差异,数值大小采用均数±标准差(X±S)表示。第二章 miR-19对肺癌细胞EMT、迁移及侵袭的调控机制1.Western blot检测稳定过表达miR-19的肺癌细胞株中EMT相关信号通路关键基因蛋白水平表达。2.双荧光素酶报告基因实验检测共转染miR-19的化学合成物后,带有双荧光素酶报告基因的MST4的报告基因活性变化,以明确MST4是否为miR-19的直接靶基因。3.慢病毒载体构建,生产慢病毒并建立稳定携带MST4或dnMST4的肺癌细胞株。4.Western blot检测EMT相关基因蛋白水平表达。5.细胞免疫荧光实验观察EMT相关基因在稳定携带MST4或dnMST4的肺癌细胞株中表达的定位和表达水平。6.Transwell迁移实验、Boyden侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力。7.在过表达miR-19发生EMT的肺癌细胞基础上再感染稳定携带MST4基因的慢病毒,建立MST4基因表达回复的稳定细胞株,并对EMT相关基因进行Western blot和Transwell迁移实验、Boyden侵袭实验的检测。8.F-actin鬼笔环肽染色试验检测稳定携带dnMST4的肺癌细胞中细胞骨架变化;Westerm blot检测细胞骨架相关蛋白活性水平。9.裸鼠皮下成瘤实验检测稳定携带dnMST4或MST4基因的肺癌细胞的在体生长情况及BrdU染色检测细胞的在体增殖情况。10.统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计分析。两组的qRT-PCR分析采用单样本t检验;双荧光素酶报告基因活性分析、transwell小室迁移实验及Boyden小室侵袭实验、BrdU染色实验两组间的比较采用两独立样本t检验;裸鼠皮下移植瘤大小的生长曲线比较采用两个重复因素的方差分析。每个实验至少独立重复3次,P<0.05则认为有统计学差异,数值大小采用均数±标准差(X±S)表示。第三章 miR-19的靶基因MST4对肝癌细胞增殖、EMT、迁移及侵袭的调控作用1.提取肝癌细胞总RNA,逆转录成cDNA后,qRT-PCR检测MST4的mRNA表达水平。2.建立稳定携带MST4或dnMST4的肝癌细胞株。3.Western blot检测MST4基因和EMT相关基因蛋白表达变化。4.Transwell迁移实验、Boyden侵袭实验检测稳定携带MST4或dnMST4基因的肝癌细胞迁移和侵袭能力。5.裸鼠皮下成瘤实验检测稳定携带dnMST4的肝癌细胞在体生长情况及BrdU染色检测细胞在体增殖情况。6.F-actin鬼笔环肽染色试验观察稳定携带dnMST4的肝癌细胞的细胞骨架变化。7.统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计分析,每个实验至少独立重复3次。qRT-PCR各肝癌细胞株2-△△Ct的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA);transwell小室迁移实验及Boyden小室侵袭实验、BrdU染色实验两组间的比较采用两独立样本t检验;裸鼠皮下移植瘤大小的生长曲线比较采用两个重复因素的方差分析。P<0.05则认为有统计学差异,数值大小采用均数±标准差(X±S)表示。结果第一章 miR-19对肺癌细胞EMT、迁移及侵袭的调控作用1.miR-19在肺癌细胞株中的表达qRT-PCR检测肺癌细胞株中miR-19的表达,结果显示各细胞株间miR-19的表达有差异(F=87.699,P=0.000),经用LSD方法对各组间进行多重比较,结果显示各肺癌细胞株中都有一定水平的miR-19表达,其中A549-luc细胞表达较低,而H23细胞与其他各细胞比较miR-19的mRNA水平最高,差异有显著性意义(P均<0.01)。2.在A549和HCC827细胞中过表达miR-19导致EMT样的分子改变为阐明miR-19对肺癌发生发展过程中的潜在功能,我们对A549细胞和HCC827细胞进行了外源性表达miR-19基因。外源性表达miR-19的A549和HCC827细胞表现出梭形、成纤维细胞样形态,提示过表达miR-19的A549和HCC827细胞可能发生了 EMT。Western Blot结果显示,过表达miR-19的A549细胞和HCC827细胞上皮性标志E-cadherin表达下降,间充质标志分子Fibronectin1(FN1)、N-cadherin、Vimentin表达上调。因此,miR-19引起了过表达miR-19的A549和HCC827细胞的间充质样表型和上皮间充质转化样的细胞分子标志物的改变。3.在A549细胞中过表达miR-19后引起与EMT、迁移及侵袭相一致的广泛基因表达谱的改变我们对过表达miR-19的A549细胞及其空载对照组细胞进行了全基因mRNA表达谱芯片分析。芯片结果显示过表达miR-19组的A549细胞与对照组细胞相比,有352个基因显著下调,501个基因的显著上调。在853个变化显著的基因中,有206个EMT、迁移及侵袭相关基因变化显著(上调:134;下调:72)。我们采用Western Blot和qRT-PCR的方法检测了芯片中与EMT、迁移和转移相关的miR-19的靶基因的表达。IGFBP3、ID2、PTEN、LPAR1、TGFB2、PIK3CD、TGFB1、PDGFA、TUBB2B、PDGFC、WNT5A、MMP10和 MMP1 的qRT-PCR结果和PTEN、MMP10、ITGA5的Western Blot结果显示,这些基因的表达变化与芯片结果一致。4.过表达miR-19后发生EMT的细胞运动能力增强和粘附能力降低我们通过transwell小室和细胞粘附实验进一步明确了过表达miR-19后发生EMT的肺癌细胞在运动性和粘附能力上的改变。Transwell小室结果显示,具有间充质样表型的过表达miR-19的A549和HCC827细胞与对照组细胞相比运动能力显著增强(t=-5.860、-7.330,P=0.002、0.000),差异具有统计学意义。过表达miR-19的A549细胞粘附能力显著降低(F=4.578,P=0.021),差异具有统计学意义。总的来说,在肺癌细胞中过表达miR-19引起了EMT并伴随了细胞迁移能力的增强和细胞粘附性的降低。5.在肺癌细胞中外源性表达miR-19使细胞骨架发生重构,促进了丝状伪足和板状伪足的形成细胞的F-actin鬼笔环肽染色实验显示,过表达miR-19后,A549和HCC827细胞受损的肌动蛋白应力纤维网络得到恢复。扫描电镜检查显示,在过表达miR-19的A549细胞表面观察到丝状伪足和板状伪足,这一结果得到过表达miR-19的A549细胞较对照细胞运动性显著增强的强烈支持。总之,在肺癌细胞中外源性表达miR-19促进了应力纤维,丝状伪足和板状伪足的形成。综上所述,我们的结果提示miR-19上调足以诱导EMT和提高肺癌细胞在体外的运动能力。6.miR-19导致发生EMT的肺癌细胞出现生长抑制MTT检测结果表明,miR-19抑制了发生EMT的A549细胞的生长(F=127.498,P=0.000),差异具有统计学意义。细胞周期实验显示,稳定过表达miR-19的A549细胞G1期细胞所占比例增加而S期细胞减少(P<0.05),差异具有统计学意义。平板克隆形成实验显示,过表达miR-19的A549细胞和HCC827细胞与对照组细胞相比,克隆形成数量减少(t=4.267、4.134,P=0.013、0.014),差异具有统计学意义。这些结果表明,miR-19导致了肺癌细胞的生长抑制效应,且部分是由于细胞周期的G1期阻滞。最后,体内实验表明,miR-19抑制了A549细胞在裸鼠体内的生长(F=45.345,P=0.000),差异具有统计学意义。为了揭示哪些基因参与了 miR-19介导的生长抑制,我们用基因芯片和qRT-PCR在转录水平上分析了一些细胞周期调控因子和细胞增殖相关分子的表达水平。基因芯片分析发现一些与生长相关的基因上调(如GNG4,MXD1,BCAT1,E2F7和DAB2)和几个生长相关的基因下调(如BTC,EHF,EREG,E2F8,CDCA7L)。qRT-PCR数据表明,过表达miR-19后转录因子E2F1、E2F2,细胞周期素CCNA2和CCNB1水平显著下降,而肿瘤抑制因子p21CIP1水平增加了至少3.5倍,细胞周期蛋白依赖性激酶CDK6在mRNA水平上表达增加(P均<0.05),差异有显著性意义。总之,miR-19限制了发生EMT的A549细胞的增殖能力,然而其潜在机制还有待研究。7.miR-19促进发生EMT的肺癌细胞存活基因芯片数据显示抗凋亡基因上调,促凋亡基因下调。对这些基因(包括BCL2A1,XIAP,IL1RAP,IRAK2,TNFAIP3,IGFBP3 和TNFRSF11A)进行的qRT-PCR验证,结果与芯片基本一致。接下来,我们检测了过表达miR-19的细胞是否也可以抵抗促凋亡信号,如TNF-α诱导的细胞凋亡。结果显示,TNF-α处理16小时后,caspase-8的活性在表达空载的A549细胞比表达miR-19的A549细胞高大约3倍(t=20.263,P=0.000),差异具有统计学意义,证实了在表达空载的A549细胞中观察到的死亡是由TNF-α凋亡信号通路激活介导的。同预期一致,引发剂caspase-8的活性与效应剂caspase-3相关联,证实了 miR-19的表达保护发生EMT的A549细胞免于TNF-α诱导的细胞死亡。因此,miR-19增强了发生EMT的肺癌细胞的抗凋亡能力。8.提出miR-19诱导肺癌细胞EMT,减慢增殖和促进存活的信号通路示意图基于上述实验结果,我们对miR-19在肺癌细胞中发挥作用的信号通路进行了推测,即miR-19过表达引起了上皮标记的受损和间充质样标记的增加,也导致了细胞外形和与形态有关的改变及与运动、侵袭相关特性的获得性改变,然而miR-19基因也调控了细胞的增殖和细胞死亡。第二章 miR-19对肺癌细胞EMT、迁移侵袭的调控机制1.过表达miR-19通过激活Akt/GSK-3β和JAK-STAT信号通路介导了肺癌细胞EMT的发生为明确miR-19介导了肺癌细胞EMT发生的信号通路,我们采用Western blot方法对EMT相关的常见信号通路中的关键成分进行了检测。结果发现,在A549和HCC827细胞过表达miR-19促进了 Akt的磷酸化,并使其下游靶基因GSK-3β磷酸化水平增高,说明在A549和HCC827细胞中上调miR-19激活了Akt/GSK-3β信号通路;过表达miR-19也促进了 A549和HCC827细胞中Stat3的磷酸化,说明在肺癌细胞中过表达miR-19能够激活JAK-STAT信号通路。2.MST4是miR-19在的直接靶基因我们通过在线靶基因预测软件,发现miR-19能够与MST4的3’UTR(3’端非编码区)发生特异性的结合。Western blot检测发现,过表达miR-19能够下调肺癌细胞中MST4的表达。以上结果说明MST4是miR-19的靶基因。为证明miR-19是直接调控还是间接调控MST4表达的,我们构建了携带野生型MST4的3’UTR的双荧光素酶报告基因载体,并对MST4是否是miR-19的直接靶基因进行双荧光素酶报告基因实验验证。结果显示,miR-19a mimics能够显著抑制MST4的3’UTR区的双荧光素酶报告基因活性(t=4.471,P=0.043),差异具有统计学意义;相反,miR-19a inhibitor能够显著增强MST4的3’UTR区的双荧光素酶报告基因活性(t=-6.163,P=0.004),差异具有统计学意义,即MST4是miR-19的直接靶基因。3.建立稳定携带MST4或dnMST4(Dominent-negative MST4)转基因的肺癌细胞株为明确miR-19是否通过下调MST4的表达介导了肺癌细胞EMT过程,我们构建了稳定携带MST4或dnMST4转基因的肺癌细胞株。我们发现,外源性升高MST4在肺癌A549细胞中的表达后,A549细胞大小较对照细胞有所减小,而对A549细胞外源性表达dnMST4后,A549细胞的大小较对照细胞有所增大,且细胞与细胞之间变得较为疏散;而在外源性表达dnMST4的HCC827细胞中,我们观察到了更为明显的形态改变,即外源性表达dnMST4的HCC827细胞由排列紧密的上皮样形态细胞,变为排列较为疏松的间充质样形态细胞。这提示,MST4功能缺失可能导致A549和HCC827细胞发生了 EMT。4.MST4能够负性调控肺癌细胞的EMT、迁移和侵袭我们用Western Blot实验和细胞免疫荧光实验对MST4功能缺失的A549和HCC827细胞进行了 EMT相关基因的检测,结果显示MST4功能的缺失的肺癌细胞上皮标志性基因ZO-1、E-Cadherin的蛋白表达下调,间充质标志性基因Fibronectin、N-Cadherin、Vimentin的蛋白表达上调。至此,我们的研究证明,MST4功能缺失导致肺癌细胞A549和HCC827发生了 EMT。通过体外迁移和快速侵袭实验证明,MST4功能缺失的A549和HCC827细胞迁移和侵袭速度明显加快(P均<0.05),差异具有统计学意义;相反,在A549和HCC827细胞中外源性表达野生型MST4基因后,细胞的迁移及侵袭能力明显减慢(P均<0.05),差异具有统计学意义。上述结果说明,MST4能够负性调控肺癌细胞的EMT、迁移及侵袭过程。5.外源性表达MST4能够回复miR-19引起的肺癌细胞EMT及迁移侵袭加快为进一步明确miR-19是否通过下调MST4基因的表达进而介导了 EMT的发生和迁移侵袭能力的增强,我们构建了在过表达miR-19基础上重新过表达MST4的肺癌细胞株,并对其进行了 EMT标志性基因的蛋白检测和体外迁移及侵袭功能实验。结果显示,在过表达miR-19基础上稳定表达MST4基因使发生EMT的细胞形态及EMT标志性基因的表达变化均得到了部分回复(vimentin下调,即miR-19引起的具有间充质细胞样形态的肺癌细胞向典型上皮样细胞转变);同时MST4基因也使miR-19引起的肺癌细胞EMT及迁移侵袭加快发生部分逆转,即miR-19引起的肺癌细胞迁移侵袭加快受到MST4基因表达的抑制。以上实验充分说明,MST4是miR-19的直接靶基因,并介导了 miR-19引起的EMT、迁移侵袭过程。6.MST4能负性调控肺癌细胞的体内增殖为明确MST4对肺癌细胞增殖的作用,我们对稳定携带dnMST4或MST4基因的A549细胞及其对照细胞进行了裸鼠皮下移植瘤实验。结果显示,MST4功能缺失的A549细胞在裸鼠皮下的移植瘤生长速度明显比对照细胞快(F=42.002,P=0.000),差异具有统计学意义;而过表达野生型MST4的A549细胞在裸鼠皮下的移植瘤生长速度明显比对照细胞慢(F=11.559,P=0.007),差异具有统计学意义。皮下成瘤的质量分析及组织中的BrdU检测实验也支持了这一结果。以上结果表明,MST4基因对A549细胞的体内增殖起负调控作用。7.MST4基因功能缺失使肺癌细胞的细胞骨架结构发生改变并使骨架相关蛋白活性增强为明确MST4参与肺癌细胞EMT、迁移和侵袭的机制,我们对携带dnMST4基因的A549和HCC827细胞及其空载对照细胞进行了细胞骨架蛋白F-actin鬼笔环肽染色,发现MST4基因功能缺失后确实导致了细胞骨架的重构,细胞内的肌动蛋白丝明显增多。Westerm Blot检测显示,MST4基因功能缺失导致A549细胞中骨架相关蛋白Rho、Rac和Cdc42活性明显增强。至此,我们认为MST4通过改变细胞骨架蛋白相关的Rho/Rac信号通路中的蛋白活性导致细胞骨架发生重构,进而参与肺癌细胞EMT、迁移和侵袭过程。但是,MST4是否也通过其他途径(如参与EMT常见信号通路:PI3K/Akt信号通路、JAK/STAT3信号通路)参与肺癌细胞的EMT、迁移和侵袭仍有待我们进一步研究。第三章miR-19的靶基因MST4对肝癌细胞增殖、EMT、迁移及侵袭的调控作用1.MST4在肝癌细胞株中的表达谱我们检测了现有的肝癌细胞株中MST4基因的mRNA水平,经单向方差分析,显示不同细胞株间MST4的mRNA水平差异有显著意义(F=20.709,P=0.000),MST4在人永生化的肝上皮细胞和肝癌细胞株中均有一定的表达,且MST4在肝癌细胞株中相比永生化的肝上皮细胞Chang liver和LO2细胞表达都较低。于是我们选取了 MST4相对低表达的Bel-7402细胞和MST4稍高表达的Bel-7404细胞进行后续实验。2.建立稳定携带MST4或dnMST4转基因的肝癌细胞株生产慢病毒建立了稳定携带MST4或dnMST4转基因(MST4基因功能缺失)的肝癌细胞株,qRT-PCR和Westerm blot检测确认MST4在稳定转染的Bel-7402和Bel-7404细胞株中都明显高表达,说明我们成功建立了稳定携带MST4或dnMST4转基因的Bel-7402和Bel-7404细胞株。3.MST4基因能够负性调控肝癌细胞的EMT、迁移及侵袭对EMT相关基因的Western blot检测结果显示,MST4基因功能缺失能够上调 Bel-7402 和 Bel-7404细胞间充质标志性基因 Fibronectin、N-cadherin、Vimentin的表达,并下调上皮标志性基因E-cadherin或α-catenin的表达;而过表达野生型MST4基因的Bel-7402和Bel-7404细胞则出现相反改变。说明,MST4基因功能缺失导致了肝癌细胞Bel-7402和Bel-7404发生EMT,而过表达野生型MST4则能够抑制Bel-7402和Bel-7404细胞EMT过程。Transwell小室迁移实验和Boyden侵袭实验显示,过表达野生型MST4的Bel-7402和Bel-7404细胞体外迁移和侵袭能力均减弱(P<0.05);而过表达dnMST4的Bel-7402和Bel-7404细胞体外迁移和侵袭能力均明显增强(P<0.05),差异具有统计学意义。4.MST4基因功能缺失能够促进肝癌细胞的体内增殖为明确MST4基因对肝癌细胞增殖的影响,我们对稳定表达dnMST4的Bel-7402细胞和Bel-7404细胞及其空载细胞分别进行了裸鼠皮下移植瘤实验,皮下移植瘤生长曲线及BrdU染色均显示,MST4基因功能缺失能够促进肝癌细胞的体内增殖(P均<0.05),差异具有统计学意义。5.MST4基因对细胞骨架的影响为明确MST4基因是否通过调节细胞骨架的重构对肝癌细胞的EMT、迁移及侵袭发挥作用,我们进行了 F-actin鬼笔环肽染色实验,结果显示过表达野生型MST4或dnMST4基因对Bel-7402和Bel-7404细胞中F-actin的影响不明显,但其是否影响Rho/Rac通路中的相关蛋白的活性尚待研究。结论1.miR-19能够促进肺癌细胞的EMT、迁移及侵袭过程,并伴随细胞的生长抑制;2.miR-19通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路和JAK/Stat3信号通路促进了肺癌细胞的EMT、迁移和侵袭;3.miR-19的靶基因MST4介导了 miR-19促进肺癌细胞的EMT、迁移及侵袭功能,并能负性调控肺癌细胞的增殖;4.miR-19的靶基因MST4能够负性调控肝癌细胞的增殖、EMT、迁移及侵袭过程;5.miR-19靶向调控MST4表达促进了肺癌细胞的EMT、迁移及侵袭过程,而miR-19介导的肺癌细胞生长抑制则是通过其他途径实现的,预示miR-19调控不同的生物学过程是通过不同的靶基因或不同途径实现的,也体现了基因调控网络的复杂性和多样性。