合方草鱼肠道抗病性初步研究

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草鱼(Ctenopharyngodon idellus,2n=48)具有生长速度快、草食性以及易于养殖等优点,在我国淡水经济养殖中占有重要地位。近年来,连续的人工自交繁育导致草鱼种质资源明显退化,生长速度减慢,病害严重,因此积极开展草鱼种质资源创新和良种选育工作具有重大意义。以锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus,2n=100)遗传灭活精子刺激草鱼卵子,通过温度休克处理使卵子染色体加倍,培育出了雌核发育草鱼。雌核发育草鱼具有生长速度快、抗病能力强等优良特性。利用雌核发育草鱼为母本,普通草鱼为父本培育出了一种新型草鱼—合方草鱼。本文以合方草鱼为材料,对其免疫特性进行了初步研究,主要研究结果如下:1)外形及倍性检测。对合方草鱼的可数性状、可量性状、染色体数目和DNA含量进行了测定。结果表明,合方草鱼与普通草鱼在外形上无显著差异(p>0.05),染色体数为48,是一种二倍体鱼。2)免疫组织特性研究。对脾脏、头肾、肠道和血液组织的形态结构、细胞类型以及免疫相关指标进行比较分析。发现合方草鱼与普通草鱼脾脏、头肾组织的形态结构、细胞类型一致,合方草鱼脾脏组织中黑色素巨噬细胞数高于普通草鱼,表明合方草鱼脾脏组织对衰老细胞和毒物具有更强的的吞噬、消除作用;在肠道切片中观察到,合方草鱼肠道皱褶杯状细胞分布密度高于普通草鱼,由于杯状细胞分泌的黏蛋白在肠黏膜表面构成具有保护作用的黏液层,因此合方草鱼肠道杯状细胞可通过增加黏蛋白的量进而对肠道发挥更强的保护作用;合方草鱼脾脏中的非特异性免疫因子溶菌酶的活性(14.4 U/L)高于普通草鱼(13.5 U/L),血液中血清的溶菌酶活性(17.71 U/L)显著高于普通草鱼(13.89 U/L)(p<0.05),溶菌酶具有广谱的抗菌作用,表明合方草鱼在非特异性免疫能力方面存在潜在优势。3)肠道病菌侵染实验。通过嗜水气单胞菌侵染实验,比较了合方草鱼和普通草鱼肠道中杯状细胞数量、黏蛋白基因(MUC2)表达、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量的变化。结果表明:在病菌侵染后的第3 d、5 d、7 d,合方草鱼肠道皱褶杯状细胞的分布密度呈现上升—下降—平稳的变化趋势。在病菌侵染后的第3d,合方草鱼杯状细胞的分布密度显著增加,在第5 d开始下降,第7d趋于平稳,而普通草鱼杯状细胞的分布密度在第5 d才出现增加,且并未观察到下降的趋势,推测合方草鱼先于普通草鱼在肠道黏膜发挥保护作用;在病菌侵染后,合方草鱼肠道中T-SOD活性呈现一直增加的趋势,而且血清中的T-SOD活性一直高于普通草鱼,清除了过量的自由基;在病菌侵染过程中,合方草鱼肠道、血清中反映生物膜脂质过氧化损伤程度的MDA含量总体上低于普通草鱼。4)肠道转录组比较分析。通过转录组测序分析了5~6月龄合方草鱼和普通草鱼肠道m RNAs的表达差异,结果显示:与普通草鱼相比,合方草鱼差异表达的m RNAs为6658个(3085个上调和3573个下调)。对差异表达的m RNAs进行GO以及KEGG富集分析,显著富集的GO term主要有细胞过程(cellular process)、单组织过程(single-organism process)、结合(binding)和细胞(cell);显著富集的信号通路主要有代谢途径(Metabolic pathways)、碳代谢(Carbon metabolism)、类固醇生物合成(Steroid biosynthesis)、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢(Cysteine and methionine metabolism),同时发现与炎症发生相关的肠道紧密连接(tight junction)通路出现富集现象,在合方草鱼肠道中体现出更强的紧密连接作用。5)肠道紧密连接通路相关基因表达分析。结合肠道转录组数据,对合方草鱼和普通草鱼的紧密连接(tight junction)通路相关基因进行实时荧光定量PCR验证分析。结果表明,在合方草鱼肠道中occludin、claudin3、claudin4、claudin7、claudin15、cingulin、JAM1和ZO-3基因的表达量显著高于普通草鱼(p<0.05),与转录组结果一致。该研究结果揭示出合方草鱼肠道紧密连接结构介导的肠道屏障功能优于普通草鱼,在抵御病原体入侵时具有潜在的优势。本研究发现合方草鱼在非特异性免疫能力方面较普通草鱼有所提高。另外,合方草鱼具有优于普通草鱼的肠道屏障功能,在抵御外界病原体侵扰时具有潜在的优势。
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