肌氨酸氧化酶(Sarcosine oxidase,EC.1.5.3.1,SOX)属于黄素蛋白氧化酶类,以FAD为辅因子,可催化肌氨酸中N-甲基的氧化还原,是检测血清或尿液中肌酐含量的关键酶之一,广泛应用于医疗诊断领域。本研究主要涉及到优化SOX基因序列,提高密码子适好性以增强表达,建立提高SOX产酶水平的发酵调控技术;合成含特异性配体的亲和介质,创建简易纯化SOX的亲和技术;解析酶的热不稳定机理,建立增强SOX稳定性的表面化学修饰技术;最后,全合成耐热性SOX,通过氨基酸序列及分子内作用力差异性分析初步诠释其稳定性机理。主要研究内容如下:基于改变基因密码子的适好性及组合发酵策略优化,提高Bacillus sp.SOX产酶水平。首先以Bacillus sp.SOX(Bs SOX)为研究对象,在不改变Bs SOX氨基酸序列的前提下,基于受体菌E.coli密码子的喜好性,理性优化Bs SOX基因序列,使其相对于E.coli的密码子适用指数提高至0.87,密码子改变率达62.8%,Bs SOX表达效率提高了33.5%。采用乳糖作为诱导物及30℃为诱导温度分别使Bs SOX的产酶水平提高了45.7%和23.4%。同时提出双阶段温度-p H调控技术,即在发酵前期(0-8 h)采用37℃,p H 7.5发酵条件,诱导阶段(8-40 h)采用30℃,p H 6.5条件进行发酵,发酵终点时Bs SOX的产酶水平为8490 U?L-1,分别比恒p H 7.5和恒p H 6.5提高了63.3%和34.9%,并且发酵周期由56 h缩短至40 h。此外,采用恒速流加乳糖策略,可将乳糖浓度维持在较为温和的稳态,更有利于菌体的生长和Bs SOX的表达,Bs SOX产酶水平达到12466 U?L-1,在双阶段温度-p H发酵基础上,其产酶水平提高了46.8%。为高效制取SOX,合成专用的亲和介质,建立一步简易纯化SOX的技术。从多种合成方案中,筛选出以4-氨基吡咯-2-羧酸为配体、乙二胺为间隔臂的亲和介质,实现了一步纯化制取SOX的新方法。琼脂糖-乙二胺-4-氨基吡咯-2-羧酸亲和介质对SOX酶分子的吸附能力(2367 U·g-1介质)较佳,LC-MS技术鉴定表明4-氨基吡咯-2-羧酸通过乙二胺已与琼脂糖载体成功偶联。经一步亲和纯化法制取的SOX酶蛋白,酶活回收率达91.2%。经SDS-PAGE凝胶电泳分析,一步法纯化的SOX已达到电泳纯。对纯化的Bs SOX进行酶学性质分析,其对底物肌氨酸的Km值及Vmax分别为141.6 mmol·L-1和0.115mmol·L-1·min-1。利用poly-lysine与酶表面羧基结合,防止酶内部疏水基团的外翻,有效提高了SOX的稳定性。通过对储存过程中Bs SOX酶液分析,发现其热不稳定机理为疏水基团暴露引起酶蛋白聚集,并且其二级结构逐渐破坏;基于Bs SOX热不稳定原因及酶分子表面酸碱性氨基酸分析,理性选择多聚赖氨酸(poly-lysine)对酶分子进行表面化学修饰,有效提高了酶稳定性。通过质谱及FTIR分析表明Bs SOX表面的羧基不同程度的与poly-lysine共价结合。DSC分析显示修饰酶的热变性温度和变性焓值(117.98℃和2916.17J·g-1)均高于游离酶(63.03℃和0.1217 J·g-1)。修饰酶对肌氨酸的Km值及Vmax均减小。修饰酶稳定性明显提高,70℃恒温水浴10 min后,仍保留26.3%的酶活力;在p H 5.0-10.0的体系中,修饰酶仍保留较高的酶活力(90%以上);经37℃保温7 d后,游离酶酶活保留率仅为7.9%,而修饰酶酶活保留率可达95.1%,酶储存稳定性得到了显著提高。Poly-lysine分子与Bs SOX的表面羧基作用形成多个共价键,在Bs SOX表面形成网络保护层,可有效抑制Bs SOX酶天然结构的松散,抵御外界环境的不利因素。全合成耐热性SOX基因,通过氨基酸序列及分子内作用力分析诠释其稳定性机理。为深入探讨SOX热稳定性机理,选择Thermomicrobium roseum的SOX(Tr SOX)序列信息为原型,优化Tr SOX密码子并成功获得表达,同时采用伴侣蛋白共表达策略,发现Gro ES-Gro EL伴侣蛋白组合及Dna K-Dna J-Grp E-Gro ES-Gro EL伴侣蛋白组合可有效增强Tr SOX的可溶性表达。最后对Tr SOX与Bs SOX的氨基酸序列及分子内作用力的差异性分析,诠释了Tr SOX热稳定性机制。Tr SOX中有利于其热稳定性的Ala、Pro、Arg和Glu等氨基酸的含量在Tr SOX中较高;同时Tr SOX中存在较强的非共价作用力,如68.2对氢键,23对离子键,179个疏水性氨基酸。Tr SOX内部在以上非共价键的共同作用下形成彼此相互交织的结构,促进了Tr SOX二级结构稳定性,增加了Tr SOX酶自身结构紧密性,在Tr SOX耐热性方面发挥着重要作用。