玉米赤霉烯酮降解菌的分离鉴定、降解特性及机理研究

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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN),又称F-2毒素,是一种类雌激素性质的真菌毒素,可由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)和串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)等代谢产生。ZEN 性质稳定,在谷物储藏、加工和烹调高温条件下均不发生降解,通过食物进入体内,危害人和动物健康。ZEN脱毒一直受到大家的关注,目前常用的物理和化学脱毒方法存在明显的缺陷,在去除毒素的同时,谷物中营养成分也被吸附或改变。因此,许多研究工作者认为目前ZEN脱毒的最佳方法是生物去毒。本论文通过富集筛选的方法从受镰刀菌毒素长期污染的小麦地分离筛选获得一株ZEN高效降解菌7D3-2,对其进行了鉴定,并研究了该菌的生长和降解特性及降解机理。主要研究结果如下:(1)ZEN降解菌的筛选和鉴定。从受镰刀菌毒素长期污染的小麦地中分离筛选获得一株ZEN高效降解菌7D3-2。通过观察菌株的生长形态、生理生化特征和16S rDNA基因gyrA基因的系统发育树的综合分析,确定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).(2)研究培养温度、初始pH、接种量、装液量等培养环境条件对ZEN降解菌7D3-2生长和对ZEN的降解特性影响。结果发现,7D3-2降解菌的最佳生长条件是30℃、pH为7.0、NaCl浓度10.0 g/L以及良好通气量;最佳降解ZEN的环境条件是:温度为30℃、pH为7.0,接种量大于10%时对ZEN降解效率较高,且当ZEN浓度小于25.0 mg/L,降解速率较快,但是ZEN的绝对降解率随ZEN初始浓度的增加而增加。(3)对降解菌7D3-2中的降解酶特性进行了初步研究。用硫酸铵沉淀的方法获得活性降解物质,并且对活性最强部分的粗提液进行了酶学特性研究。结果显示,硫酸铵饱和度在60%时所沉淀的降解物质活性最强;7D3-2中提取的粗酶液在30℃、pH 7.0条件下活力最大,该酶在20~40℃、pH为6~9的范围内能保持80%以上的酶活性;大多数金属离子当浓度在0.2 mmol/L和2 mmo/L之间能促进ZEN降解酶活性,EDTA对该酶酶活有抑制作用;酶定域实验结果表明此酶属于胞外酶。(4)对降解菌的代谢途径及其降解基因克隆进行了初步研究。ZEN在降解菌7D3-2的作用下形成了中间体化合物1-(3,5-二羟基苯基)-6’-羟基-1’-十一碳烯-10’-酮,推测7D3-2降解ZEN过程中,经历了内酯环的切割,随后发生脱羧反应,表明ZEN降解过程发生了酯酶催化。利用携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA电转化至玉米赤霉烯酮降解菌7D3-2中,在50℃诱变温度下,穿梭载体pMarA上转座子TnYLB-1随机插入到菌株基因组中,构建了菌株7D3-2的突变体文库,对文库中的突变子进行ZEN降解性能检测,目前尚未发现ZEN降解功能发生突变的有效突变子。
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