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在大多数的动物中，原始生殖细胞(Primordialgermcell,PGC)是在发育早期就特化出来的一群将要发育为成体配子的胚胎细胞。任一遗传操作品系的建立都有赖于被有效操作的生殖细胞来传递遗传信息。从某种角度而言，以建立品系为目标的全胚胎水平遗传操作，其本质是对PGC进行操作。因此，利用现代分子和细胞生物学技术建立特异、高效的PGC操作平台是一个重要课题。本研究以斑马鱼为模型，构建了多种在斑马鱼PGC特异表达外源基因的转基因品系，利用这些品系，进一步开展了如下几方面的研究内容:
1.利用DNA水平的Cre/loxP重组系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼PGC中高效的条件性基因过表达技术。首先，建立了在PGC特异表达重组酶Cre的转基因品系Tg(kop∶Cre)。其次，建立了mRFP表达沉默的效应转基因品系Tg(kop∶loP-SV40-loP-mRFP)。当Tg(kop∶Cre)品系的雌鱼与Tg(kop∶loP-SV40-loP-mRFP)的雄鱼杂交后，杂交胚胎PGC基因组中的SV40-loxP片段被100％切除。由此，获得了体细胞基因型为Tg(kop∶loP-SV40-loxP-mRFP)，生殖细胞基因型为Tg(kop∶loxP-mRFP)的杂交鱼。该杂交鱼可批量产生PGC表达mRFP的子代转基因系Tg(kop∶loxP-mRFP)。
2.利用转录水平的Ga14/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼PGC中高效、特异的基因诱导表达调控技术。首先，建立了PGC特异表达高效Ga14蛋白的激活转基因品系Tg(kopKalTA4)。其次，建立了mRFP受UAS序列调控的效应转基因品系Tg(UAS∶mRFP)。将Tg(kop∶KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS∶mRFP)的雄鱼杂交后，在shield时期到受精后25天的杂交胚胎中，mRFP都能够特异地在PGC中获得高水平的表达。这表明Ga14/UAS系统在PGC中具有高特异性，高效率和持久的作用。定量PCR结果显示Ga14/UAS系统的转录放大效应甚至高达300倍。更重要的是，通过在Tg(kop∶KalTA4)胚胎中直接注射质粒UAS∶mRFP-nos1就可以达到特异、高效、持久标记PGC的目的。这对于我们正在开展的PGC细胞中的同源重组的高效筛选有重要的指导意义。
3.组织特异细胞剔除技术是研究特定细胞类群发育和功能的重要工具。我们利用Ga14/UAS技术在PGC靶向过表达促凋亡基因，实现了在斑马鱼胚胎中高效的PGC特异剔除。首先，我们发现去除“原结构域”(pro-domain)后的Acasp3具有更高的促凋亡活性，在整体胚胎水平过表达Acasp3导致全胚水平的细胞凋亡。然后，利用PGC特异的nanos13UTR融合mRNA定位过表达技术，构建出Acasp3-UTRnos1载体在不影响整体胚胎存活的情况下特异导致PGC凋亡。尽管过表达具有强凋亡效应的puma-nos13UTR或者bmf1-nos13UTRmRNA会导致全胚水平的细胞凋亡，但是在Tg(kop∶KalTA4)胚胎中注射过表达载体UAS-mRFP-TRnos1-UAS-puma-UTRnos1仅导致PGC特异的细胞凋亡。Acasp3，puma和bmf1的促凋亡活性都能被IAP家族因子birc4的过表达所完全抑制。在此基础上，构建促凋亡基因由UAS驱动的转基因品系Tg(UA，S∶Acasp3)、Tg(UAS∶bmf1)和Tg(UAS∶puma)，当这些品系的雄鱼与Tg(kop∶KalTA4)雌鱼杂交后，荧光蛋白标记实验、原位杂交实验和细胞凋亡分析显示，杂交胚的PGC能够在早期胚胎发育中被高效、特异地剔除。
4.综合Cre/loxP的剪切重组作用和Ga14/UAS的转录放大作用，建立了外源基因在PGC中的共剔除系统。该系统包含一套激活品系Tg(loxP-kop∶KalTA4-loxP)，2套效应品系Tg(loxP-UAS∶Cre-loxP)和Tg(loxP-UAS∶Cre-UAS∶KalTA4-loxP)。在校应品系Tg(loxP-UAS∶Cre-UAS∶KalTA4-loxP)中，添加有自放大作用的表达框UAS∶KalTA4-UTRnos1。在这些转基因品系中，所有的转基因片段的两端都各有一对同向排列的loxP序列。当激活品系分别与2套效应品系杂交后，PGC特异表达的KaITA4能够特异激活UAS表达Cre，从而介导两套品系PGC基因组中loxP序列间的所有转基因片段的剪切剔除。荧光报告基因和PCR分析结果显示，如果将激活品系Tg(loxP-kopKalTA4-loP)雌鱼与效应品系Tg(loxP-UAS∶Cre-UAS∶KalTA4-loxP)雄鱼杂交，后代能将生殖细胞中的转基因片段高效剔除，这为转基因鱼的生态安全控制提供了一条新的途径。
5.PGC是胚胎发育阶段唯一能将遗传信息传递给子代的细胞类群，因此，PGC将对于濒危物种保护和重要品系的保种具有重要意义。尤其是通过建立不同生殖特性鱼类间的“借腹怀胎”技术，将有可能制备出产生供体鱼类生殖细胞的生殖嵌合体。为了达成这一目标，我们首先以小型实验室鱼类稀有鮈鲫PGC为供体，剔除了PGC的斑马鱼胚胎为受体，优化移植参数，建立了鱼类“借腹怀胎”技术途径。发育成熟的“借腹怀胎”斑马鱼能够产生正常的稀有鮈鲫精子，并与野生型稀有鮈鲫雌鱼能够繁殖出正常的稀有鮈鲫子代。更进一步，我们以经济鱼类草鱼的PGC作为供体，剔除PGC的斑马鱼胚胎作为受体，制备产生生殖嵌合体斑马鱼。结果发现草鱼PGC可以在斑马鱼胚胎中正常发育和迁移到生殖嵴区域，经过一年的生长，2尾移植草鱼的PGC的代孕斑马鱼产生的精子可与野生型草鱼卵子正常受精，而对照斑马鱼精子与草鱼卵细胞的受精胚发育异常。对受精胚进行DNA进一步分析显示“借腹怀胎”子代的基因组完全来源于草鱼，结果初步表明移植了草鱼PGC的代孕斑马鱼能够通过一年的生长，产生草鱼的精子。
总而言之，我们分别建立了基于Cre/loxP系统和Ga14/UAS系统的PGC高效基因操作平台。在Ga14/UAS系统的基础上，我们在PGC中过表达促凋亡基因可以特异地剔除PGC，这些促凋亡基因将为以后剔除斑马鱼特异细胞提供一套新的工具。同时，我们综合Cre/loxP和Ga14/UAS系统建立了外源基因共剔除系统，可以将转基因斑马鱼生殖细胞中的转基因片段剔除，这为解决转基因生态安全问题提供一条新的途径。此外，我们通过PGC靶向移植技术初步实现不同生殖特性鱼类间的“借腹怀胎”。