【摘 要】
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背景我国有10-15%的儿童血铅超过铅中毒诊断标准,成为一大公共卫生问题。儿童铅中毒表现为学习记忆下降、智力降低以及认知行为缺陷等,发育期铅暴露可引起成年期的神经行为异常以及老年期神经退行性病变,因此研究铅暴露的神经毒性机制至关重要。小胶质细胞是定居于中枢神经系统的自然免疫细胞,研究表明小胶质细胞的活化和炎症因子的增加在铅暴露导致神经元的损伤中发挥着重要作用。炎症小体作为多蛋白复合物,是自然免疫系
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目,编号:81773473；
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背景我国有10-15%的儿童血铅超过铅中毒诊断标准,成为一大公共卫生问题。儿童铅中毒表现为学习记忆下降、智力降低以及认知行为缺陷等,发育期铅暴露可引起成年期的神经行为异常以及老年期神经退行性病变,因此研究铅暴露的神经毒性机制至关重要。小胶质细胞是定居于中枢神经系统的自然免疫细胞,研究表明小胶质细胞的活化和炎症因子的增加在铅暴露导致神经元的损伤中发挥着重要作用。炎症小体作为多蛋白复合物,是自然免疫系统的重要组成部分,炎症小体活化后产生炎症因子介导自然免疫。NLRP3炎症小体是研究最广的炎症小体,在小胶质细胞活化中发挥重要作用,然而NLRP3炎症小体在铅介导的小胶质活化中的作用和机制尚不明确。本研究旨在探究铅引起小胶质细胞活化的过程中NLRP3炎症小体的作用及其机制,探讨钙离子重分布和NLRP3炎症小体活化的关系,为防治铅的神经毒性提供新策略。方法1.以不同浓度的醋酸铅溶液（0,1,5,10μmol/L）处理BV-2小胶质细胞24h,Western Blot检测NLRP3及其下游分子Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。2.使用NLRP3抑制剂MCC950预处理小胶质细胞,Western Blot检测NLRP3,Caspase-1和IL-1β的蛋白表达,ELISA试剂盒检测细胞分泌的TNF-α和IL-1β的浓度。3.利用激光共聚焦成像技术,分别用Fluo-4 AM、Rhod-2 AM和Mag-Fluo-4AM检测铅暴露后BV-2细胞的胞浆钙离子、线粒体钙离子和内质网钙离子的变化,使用钙离子抑制剂BAPTA和2-APB进一步确定铅对小胶质细胞胞内钙离子分布的影响。4.通过JC-1荧光染色检测铅对BV-2细胞线粒体膜电位的影响。5.采用钙离子抑制剂预处理BV-2小胶质细胞,Western Blot检测铅暴露后NLRP3及下游分子的蛋白表达。6.BAPTA和2-APB抑制铅暴露诱导的BV-2小胶质细胞钙离子重分布,ELISA检测细胞上清TNF-α和IL-1β的浓度。结果1.与对照组相比,随着铅暴露剂量的升高,BV-2小胶质细胞中NLRP3及其下游分子Caspase-1和IL-1β的蛋白表达量上调,并且可以被MCC950明显阻断。2.MCC950抑制NLRP3的表达后,小胶质细胞M1型活化标志物TNF-α和IL-1β的浓度明显降低。3.铅处理导致小胶质细胞胞内钙离子分布紊乱,胞质钙离子降低,线粒体钙离子超载,内质网钙离子释放。通过钙离子螯合剂BAPTA和内质网钙离子释放抑制剂2-APB可以使线粒体和内质网的钙离子失稳得到很大程度上的恢复。4.铅暴露引起小胶质细胞线粒体膜电位下降。5.恢复小胶质细胞的钙离子重分布可明显阻断铅诱导的NLRP3炎症小体激活。6.钙离子抑制剂可减少铅暴露小胶质细胞TNF-α和IL-1β的分泌,细胞活化受到抑制。结论低浓度铅暴露通过引起胞内钙离子的重新分布诱导小胶质细胞NLRP3炎症小体激活,进而影响小胶质细胞的活化。
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