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目的：近年来，具有高敏感性的RT-PCR已经被用于实体瘤微转移的检测。甲胎蛋白和白蛋白mRNA是肝细胞癌微转移检测常见的标志物。然而，由于正常肝细胞也可表达甲胎蛋白和白蛋白mRNA，故对于其在微转移检测中的意义存在争议。另外，由于肿瘤细胞存在基因异质性，原发灶和转移灶的基因表达可能不一致，因此单标志物检测微转移容易出现假阴性。鉴于以上肝细胞癌微转移检测中存在的问题，我们推测：采用多标志物联合检测可能有助于提高微转移检测的敏感性和特异性。本研究在围手术期联合检测了肝细胞癌病人外周血中肝细胞特异性的AFPmRNA和癌特异性的黑色素瘤抗原－1（MAGE-1）mRNA，以评价多标志物联合检测微转移的可行性及AFPmRNA和MAGE-1mRNA在围手术期的变化与术后转移复发的关系。方法：研究对象分为四组病例及健康志愿者：A组，组织学证实的肝细胞癌59例；B组，肝炎和肝硬化22例；C组，肝转移癌8例；D组，肝血管瘤8例；E组，健康志愿者20例。围手术期外周血（5ml）采集分别在术前、术后7天、术后28天进行。通过巢式RT-PCR技术检测外周血中AFPmRNA和MAGE-1mRNA的表达。结果：1. 系列稀释实验在有限稀释实验中发现，以AFPmRNA或者MAGE-1mRNA为标志物，每5ml全血中最少可检出10个肝癌细胞(HepG2)。2.术前外周血微转移检测2.1 AFPmRNA检测A组肝细胞癌病人术前外周血标本中，AFPmRNA的检出率为55.9%(33/59)。AFPmRNA的检出率和TNM分期相关。另外，当肝癌直径大于5cm、多结节、伴门静脉癌栓、CD44v6表达阳性时，AFPmRNA的检出率明显提高。而血浆甲胎蛋白水平、肝癌分化程度、肝外转移等与AFPmRNA的检出率无明显相关。对照组中，B组AFPmRNA的检出率为13.7%(3/22)；其余C、D、E组均未检出AFPmRNA。<WP=9>2.2 MAGE-1mRNA检测在A组肝细胞癌外周血样本中，MAGE-1mRNA的检出率为44.1％（26/59），并和肝癌结节数目、门静脉癌栓、肿瘤直径、TNM分期、CD44v6等临床参数密切相关（P<0.05），而与血浆甲胎蛋白水平、肝癌分化程度、肝外转移等无明显相关（P>0.05）。对照组中，C组肝转移癌病人中MAGE-1mRNA的检出率为37.5％（3/8），其余B、D、E组均无MAGE-1mRNA检出。2.3 AFPmRNA和MAGE-1mRNA表达的关系AFPmRNA和MAGE-1mRNA在A组59例肝细胞癌病人外周血中的检出率分别为55.9％和44.1％，但67.8％的病人至少表达一种标志物。AFPmRNA和MAGE-1mRNA的检出显著相关（P<0.05），相关系数为0.307。3.术后微转移的检测3.1 AFPmRNA的检测41例肝癌病人中，18例术前检出AFPmRNA，检出率为43.9％。其中6例术后仍持续阳性（A1组）；7例病人术后一周未检出AFPmRNA，而术后28天检测阳性（B1组）；5例病人术后一周检测呈阳性或阴性，但术后28天检测均呈阴性（C1组）；其余23例病人术前和术后检测均呈阴性（D1组）。术前外周血AFPmRNA的检出和术后转移复发无明显相关性（P>0.05）。在术后最长16个月的随访期间，转移复发的病例是A1组2例（2/6）、B1组6例（6/7）、C1组1例（1/5）、D1组5例（5/23）。其中B1组复发率与A1和C1组无显著差异但和D1组有显著差异（P<0.01）。3.2 MAGE-1mRNA检测在行根治性外科治疗的41例肝癌病人中，MAGE-1mRNA的术前检出率36.6％（15/41）。其中3例术后仍持续阳性（A2组）；3例术后一周转为阴性，但术后28天重新转为阳性（B2组）；9例术前虽然阳性，但术后28天转为阴性（C2组）；其余26例围手术期检测均为阴性（D2组）。术前MAGE-1mRNA的检出和术后的转移复发无明显相关（P>0.05）。术后转移复发情况是：A2组3例（3/3）、B2组2例（2/3）、C2组1例（1/9）、D2组8例（8/26）。根据医学合理性原则，将A2和B2组合并为AB2组进行统计分析。AB2组较C2和D2组更容易在近期内转移复发（P<0.05）。3.3 双标志物RT-PCR在41例随访的肝细胞癌病人中，以术后28天检测结果为标准，MAGE-1mRNA的检出率为14.6％（6/41）、AFPmRNA的检出率为31.7％（13/41）；3例病人AFPmRNA和MAGE-1mRNA双阳性（I组）、13例病人检出一种标志物（II组）、25例病人两种标志物均未检出（III组）。在I组中，3例病人在术后6月内全部复发；在II组中，7例病人在术后7个月内复发（53.8％）、III组中，4例病人在随访期间复发（16％）。I组和II组的复发率与III组有显著差异（P<0.05）。<WP=10>结 论1.以AFPmRNA或MAGE-1mRNA为标志物，通过巢式逆转录PCR来检测肝细胞癌病人外周血微转移是可行的。联合检测肝细胞特异性的AFPmRNA和癌细胞特异性的MAGE-1mRNA有助于提高肝细胞癌外周血微转移检测的敏感性和特异性。2.术前微转移的检出和术后复发无明显相关性。但术后28天AFPmRNA 或MAGE-1mRNA的检出对于术后6月内的转移复发有预警意义，而且联合检测AFPmRNA 和MAGE-1mRNA可以提高预测复发的敏感性和特异性