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骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是TGF-β(Transforming growth factor-β)家族成员之一,具有多种生物学功能,在体内不仅可以诱导骨的形成,还是胚胎发育阶段必需的细胞调节因子,在神经系统发育及造血组织的发育和修复等方面具有重要作用和广泛的临床应用前景。由于天然BMP-2来源受限,因此重组人骨形成蛋白-2(recombinant human bonemorphogenetic protein-2,rhBMP-2)的表达研究受到广泛关注。本课题进行了hBMP-2在大肠杆菌中发酵条件的优化研究,并对表达产物rhBMP-2进行纯化及生物学活性鉴定。
首先,研究了重组质粒pBV220/hBMP-2在不同宿主菌中表达rhBMP-2的差异,结果表明以E.coli DH5α为宿主菌,rhBMP-2表达量最高,表达量占菌体总蛋白的19.80％,菌体干重为2.22g/L。为进一步提高rhBMP-2表达量,研究了甘油浓度、无机盐离子浓度以及表达条件对rhBMP-2表达的影响。结果表明以SOB为基本培养基,添加1.2％甘油,2mmol/L NaCl有利于rhBMP-2的表达；优化后表达条件为：37℃,250r/min,培养2h,接种量为8％,42℃诱导表达4h。采用优化培养基和表达条件后可使rhBMP-2的表达量达到31.28％,菌体干重为2.63g/L。通过Western Blotting鉴定,证明表达蛋白为rhBMP-2。
然后对重组大肠杆菌表达的rhBMP-2包涵体进行纯化和复性。采用溶菌酶和超声波结合裂解细菌,离心收集包涵体；包涵体经二次洗涤后纯度达到64.28％。洗涤后的包涵体经8mol/L尿素溶解变性后,进行Sephacryl S-200凝胶层析纯化得到纯度>95％的rhBMP-2。采用稀释复性和透析复性rhBMP-2,并对rhBMP-2复性的多个影响因素进行了探索,结果表明100μg/ml rhBMP-2在10℃对含有0.75 mol/LCHES的复性液中透析复性效果较理想,复性率为46.2％。利用成熟hBMP-2的N端含有的肝素结合域,对复性蛋白液进行肝素亲和层析纯化得到rhBMP-2二聚体。
纯化制备的rhBMP-2二聚体进行细胞碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性检测；实验结果表明,复性纯化得到的rhBMP-2二聚体在第4天和第6天对MC3T3E1前成骨细胞具有明显的诱骨作用。