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猪既是一种在我国畜牧业生产中占有极大比重的重要经济动物,同时还是生物医学中常用的理想医学模型。然而猪多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)的建系仍未完全成功,并且对其多能调控机制的了解尚不清楚。因此,深入研究猪多能干细胞的多能调控机制,将为猪多能干细胞的建系提供理论基础。H3K9甲基化修饰是重要的表观抑制标记,在小鼠上的研究表明其是重编程过程中重要的表观障碍。而组蛋白去甲基化酶KDM3A和KDM3B可通过羟基化作用去除H3K9me1/2来维持干细胞的自我更新能力。因此,研究两者在猪多能干细胞中的功能机制,将更深入了解H3K9甲基化对多能干细胞的调控方式,并有利于解决当前猪内源多能调控网络激活不完全的问题。在本研究中,我们以实验室已建立的以药物介导的外源基因表达的猪诱导性多能干细胞为实验材料,分析了H3K9甲基化修饰状态转换对其自我更新能力的影响,并揭示了以KDM3A/KDM3B/OCT4/SOX2为核心的H3K9去甲基化调控机制。实验结果如下:1.全基因组水平的H3K9的低甲基化状态对于猪i PSCs多能性的维持至关重要。本研究以DOX-i PSCs为研究对象,通过撤去DOX及LIF、b FGF、CHIR99021、SB431542,使i PSCs逐渐丧失多能态。研究发现猪i PSCs在该培养条件下,逐步丧失克隆形态且AP染色呈现阴性。外源多能基因已完全沉默,且内源多能基因OCT4、SOX2、LIN28A、NANOG表达量显著下调。此外,在这一分化进程中细胞整体的H3K9me1/2/3水平显著升高,而H3K4 me1/2/3的整体水平显著下降。这些结果表明H3K9甲基化修饰与猪多能干细胞多能性维持紧密相关。2.饲养层细胞与外源多能基因协同维持i PSCs整体H3K9低甲基化状态。我们进行了一系列的体系筛选,结果表明当撤去饲养层细胞(Feeder free,F-)时,i PSCs整体H3K9甲基化水平升高。进一步分析显示在无饲养层体系下,不添加DOX(Feeder and DOX free,FD-)会使i PSCs的H3K9甲基化水平进一步升高。此外,核心多能基因(OCT4/SOX2)整体蛋白水平也显著下降,同时细胞表达外胚层与中胚层的分化标记。EDU染色试验与Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测表明,细胞增殖能力快速下降且出现凋亡现象。转录组测序分析表明Feeder通过促进SOX家族的基因转录来维持猪i PSCs多能性。以上结果表明Feeder可能通过降低猪i PSCs中多能性相关基因区域的H3K9甲基化修饰,进而激活多能基因的表达,维持多能性。并且由DOX所控制的核心转录因子也可能参与了这一调控过程。3.猪i PSCs多能性丧失过程中,H3K9甲基化阻碍关键多能转录因子与其下游靶基因的互作。对正常培养的与FD-处理下的DOX-i PSCs进行H3K9me2/3的Ch IP-seq分析,结果表明整体H3K9甲基化丰度在FD-处理中显著升高。进一步Motif分析显示在FD-特异的H3K9me2区域富集出OCT4、SOX2、ESRRB等多能转录因子的结合模序,而正常培养条件下特异的甲基化区域富集出c-Jun、ATY13等体细胞特异基因结合模序。进一步将Ch IP数据与转录组测序数据联合分析显示,H3K9甲基化不但参与了分化进程中多能基因的沉默进程,同时在多能态下,也参与了体细胞相关基因的沉默。这些试验结果表明核心多能转录因子激活下游基因进程中,多能性相关基因区域的H3K9去甲基化是必要的。4.组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/KDM3B与核心转录因子OCT4/SOX2形成转录驱动复合物维持干细胞多能态。我们在DOX-i PSCs中进行了KDM3A与KDM3B的干扰试验,结果表明两者在H3K9去甲基化作用上存在功能互补现象,只有同时下调两者表达,猪i PSCs的H3K9me2/me3水平才会显著上升,细胞增殖也受到严重抑制并发生凋亡现象,AP染色呈现阴性。此外,过表达试验显示两者均可以显著降低细胞整体的H3K9甲基化水平,但两者之间存在一些表型差异。过表达KDM3A有效的提升了细胞的增殖与抗凋亡能力并促进了多能相关基因的表达,但过表达KDM3B却轻微抑制了细胞的增殖能力且对多能性无显著影响。为进一步解析多能转录因子与H3K9去甲基化作用的关系,我们首先通过单因子回补试验证明了DOX-i PSCs的维持主要依赖于OCT4与SOX2的足量表达。Ch IP-seq分析显示两者共同作用于基因间区与内含子区域的增强子激活多能性相关基因与通路维持多能态,但OCT4/SOX2并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达。将H3K9me2/3与OCT4/SOX2的Ch IP-seq进行联合分析,发现在FD-处理后大约20%的OCT4/SOX2的结合区域发生了H3K9me2。对KDM3A与KDM3B使用免疫共沉淀联用质谱分析技术(Immunoprecipitation-Mass Spectrometry,IP-MS)来鉴定并分析两者的关联蛋白。结果表明两者之间存在直接的相互作用,进一步分析发现KDM3A与KDM3B的互作蛋白分别包含有SOX2与OCT4,且富集出大量染色质重塑蛋白,如HMG家族的HMGB2、HMGA1等。这些证据表明OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合物形成一个转录驱动复合物定向激活多能相关基因的表达。综上所述,本研究揭示了以KDM3A和KDM3B为核心的H3K9去甲基化作用在多能性维持中的重要作用,发现了组蛋白去甲基化酶通过形成蛋白复合体的形式来发挥转录激活作用。此外,我们还证明了组蛋白去甲基化的定向作用是通过与多能性转录因子的结合来实现的,这一转录激活机制不仅为猪多能干细胞的建系工作提供了理论基础,而且丰富了人类对于表观遗传激活机制领域的理解。