纳豆是一种日本传统的发酵产品,纳豆中的纳豆激酶（NK）是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,可口服吸收,溶解血栓,溶栓效率高；相比传统的尿激酶和链激酶等药物,有快速溶解血栓、半衰期长、副作用小等优点。因此纳豆激酶是一种具有巨大开发潜力的食源性溶栓药物,引起医药及食品研究领域的广泛关注。纳豆激酶基因（aprN）全长1146bp,包含一个完整编码阅读框,编码381个氨基酸,前29个氨基酸残基组成信号肽序列（signal peptide）,后跟一段77个氨基酸残基组成的前导肽（propeptide）和275个氨基酸残基组成的成熟肽（mature peptide）,根据aprN基因序列和质粒pET28a的性质,设计引物,优化PCR条件,确认最佳反应条件为：94℃预变性2min,94℃变性30s,退火温度55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环后,72℃延伸10min。在此条件下,从纳豆杆菌克隆到高特异性的aprN基因。将PCR产物成功克隆至表达载体pET28a上,经双酶切鉴定,证明克隆到pET28a载体上的基因即为aprN基因。将重组质粒pET28a-aprN进行双酶切验证后转入E.coli BL21（DE3）中,对重组菌的生长规律进行研究,aprN基因的导入对宿主细胞没有明显影响。重组菌的诱导表达研究表明：20℃下培养、IPTG添加量为0.4mmol/L、培养20h时表达产物的纤溶活性最大,可达至81.73U/mL, SDS-PAGE检测观察到一条38KD的蛋白条带,与预期相符。为了进一步提高外源基因的稳定性及表达量,将aprN基因克隆到粟酒裂殖酵母S. pombe yAS56中进行研究。首先根据aprN基因和质粒pESP-2的性质重新设计引物,探索PCR反应条件,得到特异性带较好的aprN基因片段,成功构建重组质粒pESP-2-aprN,转入大肠杆菌DH10B中,经过双酶切鉴定,证明克隆至pESP-2质粒上的外源基因即为aprN基因。采用醋酸锂转化法将重组质粒pESP-2-aprN转入yAS56中,在选择性培养基中进行筛选培养。对转化子进行菌落PCR,结果证明外源基因已导入酵母细胞中。通过纤维蛋白平板法检测发现,细胞破碎液上清中发现有纤溶活性,但活性较低,细胞培养上清液中没有发现纤溶活性。SDS-PAGE检测表明：细胞破碎液中发现一条明显与预期蛋白相符的条带,细胞上清液中没有此条带,说明目的蛋白在胞内表达,没有分泌至胞外。