研究背景心房颤动（房颤）是临床上最常见的快速性心律失常,其发病率随年龄增长而逐渐升高。房颤能显著增加脑卒中、心力衰竭、痴呆等并发症风险,并造成极高的致残率和致死率,严重危害人类健康。因此,房颤已成为当今社会一个重要的公共卫生负担。然而,当前针对房颤可用的内科治疗方法均未达到理想的治疗效果。究其原因,主要是房颤的发生机制尚未十分明了,难以实施早期预防措施及精准的靶向治疗。目前公认的房颤主要发病机制包括电重构、结构重构、自主神经系统重构等。microRNAs（miRNAs）参与房颤的重构机制已受到广泛重视。miRNAs是内源性的高度保守的非编码小RNA分子,通过与靶miRNA碱基配对负调控靶基因的表达。研究发现miRNAs在心肌病、心衰和动脉粥样硬化等心血管疾病中发挥重要作用。miR-124-3p被证实在急性心肌梗死中异常上调,能抑制炎症反应和心肌细胞的凋亡。一些miRNAs包括 miR-21、miR-26、miR-29b、miR-30、miR-133 和 miR-590 参与了心房重构和纤维化。因此,这些新发现为miRNAs参与房颤的结构重构提供了理论依据。外泌体是由细胞分泌的膜源性囊泡。外泌体携带多种分子成分,包括蛋白质、脂质、mRNAs和miRNAs。含有miRNAs的外泌体被分泌到循环中,在细胞间的通讯中发挥重要作用,并影响生理和病理过程。先前有研究发现,房颤和窦性心律（窦律）患者之间外泌体中miRNAs的表达存在差异,这些miRNAs被预测可调节靶基因参与氧化应激（如MAPK）、纤维化（如WNT）和其他信号通路影响房颤。然而,外泌体中miRNAs参与房颤发生的确切机制仍不清楚。本研究旨在筛选房颤患者血浆外泌体中差异表达的miRNAs,并探讨其如何调控靶基因影响房颤的发生。本研究共分为两部分。第一部分,从临床中筛选房颤及窦律患者,分别从其血浆中提取外泌体,通过高通量测序分析其中显著差异表达的外泌体miRNAs,进一步扩大样本量并通过qRT-PCR验证其中差异表达的miRNAs。通过靶基因预测、生物学功能及信号通路分析,进一步预测可能参与房颤发生的靶miRNA及其作用机制。第二部分先通过体外实验,通过功能获得和缺失实验验证目标miRNA对房颤的影响及作用机制,再通过体内试验进一步验证目标miRNA对心肌纤维化的影响。从而进一步阐明房颤发生的分子机制,为寻找潜在治疗靶点提供线索与依据。研究方法1.纳入研究人群及样本采集根据预先制订的纳入及排除标准招募房颤及窦律患者。采集每名患者10mL空腹全血,在4℃下以3000g离心10分钟以去除细胞成分,收集含有血浆的上层澄清液并在-80℃条件下储存。2.血浆外泌体的分离将血浆在3000 g离心15分钟以清除碎片,取上清在4℃下以16500 g离心30分钟,然后在4℃下以110000 g离心70分钟离心共2次。含有外泌体的最终沉淀在-80℃冷冻,用于RNA或蛋白质分析或与大鼠心肌成纤维细胞共培养。3.外泌体的鉴定用透射电子显微镜观察外泌体形态。然后使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）分析粒径浓度和分布。用Western blot分析外泌体阳性标记CD63、Hsp70、TSG101和阴性标记Calnexin的表达情况。从外泌体中提取RNA,并检测RNA样品的浓度和纯度。4.高通量测序筛选差异表达的miRNAs并验证选取房颤患及窦律患者各3名,对血浆外泌体中miRNA进行二代高通量测序,检测两组患者中差异表达的miRNAs。并进一步扩大样本量行qRT-PCR验证测序结果的准确性。5.生物信息学分析筛选与房颤心房纤维化相关的通路及目标miRNA利用miRanda软件预测差异表达miRNA的靶基因和信号通路。通过GO分析预测差异表达的miRNAs的生物学功能。通过KEGG通路分析分析预测差异表达miRNAs的信号通路。并在此基础上综合所有结果筛选出与心房纤维化相关的显著差异表达目标miRNA。6.分离及培养大鼠原代心肌成纤维细胞分离大鼠原代心肌成纤维细胞。原代心肌成纤维细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,每2-3天换液一次。7.外泌体与心肌成纤维细胞的共培养（1）提取房颤患者血浆外泌体,并用PKH67绿色荧光染料标记,与大鼠原代心肌成纤维细胞在37℃的5%CO2培养箱中共孵育0h、8h和16h。孵育结束时用DAPI染色。在共聚焦激光扫描显微镜下观察。（2）从房颤和窦律患者中分离的外泌体分别与大鼠原代心肌成纤维细胞共孵育。心肌成纤维细胞共孵育24h后提取RNA,进行qRT-PCR检测miR-124-3p的表达水平。8.质粒转染心肌成纤维细胞使用含有miR-124-3p过表达质粒、miR-124-3p抑制质粒和阴性对照质粒分别转染大鼠原代心肌成纤维细胞。转染后,用EDU染色测定细胞增殖情况。细胞转染48小时后,用CCK8法测定细胞活性。感染48小时后分别提取RNA和蛋白备用。9.腺相关病毒感染动物选取18只成年健康雄性Wistar大鼠,体重约为240-260g,随机分为3组:（1）miR-124-3p上调组;（2）miR-124-3p上调组+Wnt/β-catenin通路抑制剂组MASB;（3）阴性对照组。尾静脉注射腺相关病毒感染14天,通路抑制剂处理14天,对各组大鼠行电生理检查,测定心房有效不应期和房颤诱发率。检查完毕后处死大鼠,低温留取左房组织备用。10.分子生物学指标检测TRIzol法提取感染后细胞的总RNA,qRT-PCR方法检测miR-124-3p的表达量。提取细胞和组织的蛋白,应用Western blot方法测定用于检测靶基因、信号通路蛋白和纤维化蛋白指标表达量的变化。11.组织病理学检查分离左心房组织并用4%的多聚甲醛固定。将样品嵌入石蜡中并切成4 μm的薄片。进行Masson染色评估心房肌肉组织的形态变化和心房纤维化的程度。12.双荧光素酶报告验证靶基因在AXIN1的3’UTR中假定的miR-124-3p结合位点（包括野生型和突变型）克隆到pmir-GLO荧光素酶载体中。将荧光素酶载体分别与miR-NC或miR-124-3p mimics共转染到293T细胞中。转染48h后,在GloMaxTM20/20光度计上使用双荧光素酶检测试剂盒裂解细胞并进行检测组萤光素酶的信号值。研究结果1.本研究共招募房颤患者43例,窦律患者43例。房颤组患者左心房直径明显大于窦律患者组（P＜0.01）。房颤组BNP水平高于窦律组（P＜0.05）。其他指标如年龄、体重、身高、BMI和LVEF等均无统计学意义。此外,用于外泌体测序的3例房颤患者与3例窦律患者的上述指标无显著统计学差异。2.通过电子显微镜观察外泌体的大小和形状,其中直径30-150 nm的片状囊泡为外泌体。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示,房颤患者和窦律患者的外泌体大小分布相似。Western blot分析,来自房颤和窦律患者的血浆外泌体与对照细胞相比,外泌体标志物CD63、HSP70 和 TSG101 阳性,Calnexin 阴性。3.高通量测序结果显示:与窦律组相比,房颤组中共有852个miRNAs表达一致,其中13个miRNAs表达上调,27个miRNAs表达下调（P＜0.05）。其中有9个miRNAs被报道与心脏疾病有关。选取8个差异表达的miRNAs（其中5个上调,3个下调）,通过 qRT-PCR 验证测序结果。结果显示,miR-124-3p、miR-378d、miR-2110、miR-3180-3p 均显著上调,miR-223-5p、miR-125a-3p、miR-1299 下调。其中 miR-574-3p 验证结果为下调,与测序结果不符。4.与窦律患者相比,房颤患者miRNAs的靶基因涉及细胞成分、分子功能和生物学过程（如细胞粘附、细胞连接和金属离子结合）。KEGG分析共预测144条信号通路,其中钙信号通路（hsa04020）、WNT信号通路（hsa04310）、胰岛素分泌信号通路（hsa04911）、cGMP-PKG信号通路（hsa04022）均位于前20位。其中WNT信号通路与心肌纤维化相关。结合KEGG通路分析和TargetScan方法,我们预测miR-124-3p可能通过调控AXIN1影响WNT信号通路的关键因子β-catenin蛋白的表达,从而影响心房纤维化。5.用PKH67标记外泌体,并与心肌成纤维细胞共孵育。荧光显微镜分析结果显示,大鼠心肌成纤维细胞吸收了荧光,外泌体进入细胞的数量随时间逐渐增加。结果证明外泌体可以被心肌成纤维细胞摄取。6.与窦律患者外泌体相比,来自房颤患者的血浆外泌体与心肌成纤维细胞共培养24h后,大鼠心肌成纤维细胞中miR-124-3p显著上调。结果表明来自房颤患者外泌体可被成纤维细胞摄取并能影响miR-124-3p的表达。7.使用含有miR-124-3p过表达质粒、miR-124-3p抑制质粒和阴性质粒分别感染大鼠原代心肌成纤维细胞。当miR-124-3p上调时,EDU标记荧光染色和CCK-8结果均显示细胞增殖和活力明显增加。同时,当miR-124-3p下调时,心肌成纤维细胞的增殖和活力明显下降。与miR-124-3p抑制组相比,miR-124-3p过表达组的AXIN1在mRNA和蛋白水平上均显著下调。miR-124-3p过表达组中的β-catenin、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表达水平上调,而在miR-124-3p抑制组上述蛋白表达水平均下调。8.使用含有miR-124-3p上调的腺相关病毒感染大鼠,并使用Wnt通路抑制剂阻断Wnt/β-catenin通路。心电生理检查发现:与阴性对照组、miR-124-3p上调+Wnt通路抑制剂组相比,感染miR-124-3p上调大鼠组房颤诱发率增加,心房有效不应期缩短。在miR-124-3p上调组中Collagen Ⅰ的蛋白表达量要明显高于阴性对照组及miR-124-3p上调+Wnt通路抑制剂组。对获得左房组织标本进行Masson染色,染色结果显示miR-124-3p上调组中心肌纤维化的程度明显高于其余两组。9.与对照模拟组相比,miR-124-3p模拟物与野生型荧光素酶报告质粒的共转染结果显示荧光素酶活性显著降低,而突变型荧光素酶活性没有改变。荧光素酶报告基因检测显示AXIN1 3’ UTR是miR-124-3p的直接靶基因。结论1.房颤患者与窦律患者相比,血浆外泌体中存在显著差异表达的miRNAs。生信分析预测miR-124-3p通过靶基因AXIN1调控Wnt/β-catenin信号通路参与心房纤维化并可能影响房颤发生。2.体外试验验证miR-124-3p能通过AXIN1调控Wnt/β-catenin信号通路促进心肌成纤维细胞的增殖和活性升高,细胞外基质蛋白分泌增加,为心房纤维化形成的重要基础。3.通过腺相关病毒感染大鼠和Wnt通路抑制剂抑制作用通路,体内试验及双荧光素酶实验等手段证实miR-124-3p通过靶基因AXIN1调控Wnt/β-catenin信号通路促进心房纤维化从而参与房颤的发生。