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沙门菌（Salmonella）是重要的食源性人兽共患病原菌之一,严重着危害畜禽产业发展和人类健康。迄今为止,已发现的沙门菌血清型高达2600多种。目前,我国沙门菌的检测标准仍是微生物培养法,但其操作复杂,需要至少3天的选择性富集培养。因此,通过沙门菌特异性靶标建立诸如免疫磁珠等快速富集技术对提高沙门菌检测效率具有重要意义。沙门菌外膜蛋白是一类能刺激机体产生较强体液免疫应答和较高抗体水平的抗原,并作为毒力因子在细菌的致病过程中发挥重要作用。PhoN蛋白是沙门菌的一种外膜蛋白,是一种非特异性酸性磷酸酶,可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,具有良好的免疫原性。更重要的是,PhoN存在于绝大多数血清型的沙门菌中,而在大肠杆菌等非沙门肠杆菌科细菌中则不存在,显示出作为沙门菌属检测靶标的应用潜能,相关研究尚未见报道。目前,单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）广泛的应用于包括沙门菌在内的病原微生物的检测。基于McAb的检测及诊断应用,如免疫富集磁珠和血清学诊断试剂盒等,可对沙门菌进行快速检测及诊断。近年来,小型化抗体成为疾病诊断与治疗领域抗体技术的热点之一。驼科动物血液中存在缺失L链的重链抗体（heavy chain antibody,HcAb）抗体,利用特异性引物克隆其可变区,获得单域重链抗体（variable domain of heavy chain of HcAb,VHH）,又被称为纳米抗体（Nanobody,Nb）,是目前最小的功能性抗原结合片段。Nb因其相比传统McAb具有一系列优点,在抗肿瘤、抗病毒、病原微生物检测等领域展现广阔前景。目前制备纳米抗体较成熟的方法为噬菌体展示技术,可以高通量筛选较大库容量的抗体文库。本研究以沙门菌外膜蛋白基因phoN为目的标靶,成功获得大肠杆菌表达的PhoN重组蛋白。使用PhoN蛋白免疫小鼠,筛选获得PhoN的传统单克隆抗体,并基于PhoN单抗制备了免疫磁珠,可特异性捕获沙门菌;同时,将重组蛋白免疫羊驼,通过构建噬菌体展示文库筛选获得针对PhoN的特异性Nbl和Nb2序列,经大肠杆菌表达获得纳米抗体Nb2;基于PhoN两种抗体分别制备沙门菌免疫磁珠,可对沙门菌进行有效富集,且基于Nb2制备的磁珠特异性更高,为沙门菌的快速富集和检测提供了重要材料基础。1沙门菌PhoN蛋白传统单抗的制备及初步应用以鼠伤寒沙门菌ATCC14028S的DNA为模板,克隆phoN基因,经一步法分别连接构建至原核表达载体pCold I和pGEX-6P-1,获得pCold和pGEX-6P-1-phoN的重组质粒,经PCR鉴定及测序结果验证正确后,分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,获得沙门菌PhoN蛋白的两种重组表达菌,分别经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE,其结果显示两种标签的PhoN重组蛋白均以可溶性上清的形式表达,分别使用His和GST标签的纯化柱纯化后获得纯度较高的重组PhoN蛋白,其分子量大小分别为28 kDa和54 kDa左右,与预期理论大小相符,通过Western Blot试验,结果显示目的蛋白与相应标签蛋白抗体均有良好的免疫反应性。使用His-PhoN蛋白3次免疫小鼠,应用杂交瘤淋巴细胞技术,经过3次亚克隆和ELISA筛选后获得5株稳定分泌抗PhoN蛋白单抗的杂交瘤细胞株,且均可以特异性识别并结合重组PhoN蛋白,而不与His-PdgL、His-OmpC和His-OmpF等其他沙门菌重组蛋白反应,显示出良好免疫反应性;制备4B2腹水并进行纯化,通过Western Blot试验,分析其结果显示4B2单抗能与肠炎、鼠伤寒、德尔卑、婴儿沙门菌、印第安纳、伦敦、科瓦利斯、里森等不同血清型沙门菌特异性反应,而与大肠杆菌、志贺杆菌、空肠弯曲菌和单核细胞增生李斯特菌等非沙门菌不反应,表明该单抗具有沙门菌特异性识别的特性。将4B2单抗偶联Fe3O4羧基磁性纳米微球,制备基于PhoN单抗的免疫磁珠,免疫富集试验结果显示其可对鼠伤寒、肠炎、德尔卑、婴儿、科瓦利斯和里森沙门菌进行富集,其中对鼠伤寒沙门菌的捕获效率最高,可达80%,为沙门菌检测中样品的免疫富集预处理提供了重要的生物材料储备。2沙门菌PhoN蛋白纳米抗体的制备及初步应用使用His-PhoN蛋白通过皮下注射方式免疫成年羊驼,提取外周血总RNA并反转录,扩增VHH基因;胶回收第一轮PCR 700 bp条带进行第二轮PCR,胶回收第二轮PCR450bp左右的条带,即为VHH目的片段。将VHH目的片段连接至pCANTAB5E载体后转化TG1感受态细胞,涂布在Amp抗性的LB培养基,通过对涂布后的平板进行计数及VHH特异引物扩增验证,最终得到库容量为4.6×108 CFU/mL、插入率为91.6%的羊驼重链可变区噬菌体展示文库。经过噬菌体文库的救援后,使用噬菌体ELISA方法淘选特异性VHH克隆并制备纳米抗体粗提物,并利用包被GST-PhoN蛋白的间接ELISA对其进行M13和E-tag检测,选取阳性克隆进一步测序验证,使用DNAMAN分析氨基酸序列,获得2条PhoN特异性纳米抗体序列Nb1和Nb2。构建pCold I-Nb2重组质粒,通过原核表达系统表达纳米抗体Nb2,进行SDS-PAGE和Western Blot试验,结果显示获得了特异性识别沙门菌PhoN蛋白的可溶性Nb2纳米抗体。将Nb2偶联Fe3O4羧基磁性纳米微球,制备免疫磁珠,免疫富集试验结果表明其可对鼠伤寒、肠炎、德尔卑、婴儿、科瓦利斯和里森沙门菌进行富集,捕获效率与传统免疫磁珠相当,但特异性更高,对猪肉样品中沙门菌的富集效率可达79%,为沙门菌检测中样品的免疫富集预处理提供了重要的生物材料储备。