研究背景:年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration,AMD)是导致老年人失明的主要疾病,其可以损害视网膜的中央区域(黄斑)。在疾病早期阶段的病理特点是玻璃膜疣的存在,这是一种细胞外沉积物。主要由蛋白质、脂质和炎症介质构成。随着病情的加重,可发展为晚期AMD。晚期AMD主要包括两种类型:地图性萎缩或新生血管性萎缩,即干性和湿性AMD。早期AMD,通常是黄斑区的玻璃膜疣形成。随着疾病的进展,黄斑区可形成地图性萎缩,即干性AMD,其特点是RPE细胞的衰老和损伤,而湿性AMD的特点是RPE细胞和脉络膜血管异常生长和变性。干性AMD是一种慢性疾病,通常会导致不同程度的视觉障碍;而湿性AMD如果不接受治疗可能迅速发展为失明。AMD是一个复杂的多因素疾病,其主要原因是衰老。在视网膜老化过程中,氧化应激和活性氧自由基(ROS)已得到了广泛的承认,在疾病的病理生理过程中起着重要的作用。视网膜对氧化应激高度敏感。这是由于其高耗氧、高代谢活性、和光暴露。过量的活性氧的水平可以损害脂质、蛋白质和核酸。这个过程最终导致细胞死亡。由于玻璃膜疣含有高含量的氧化蛋白质,AMD患者的视网膜氧化损伤明显增加,此外,蛋白质含量增加也增加了氧化还原敏感性。越来越多的证据表明,炎症在干性和湿性AMD中起着重要的作用。积累的炎性成分如不仅包括轻度浸润的巨噬细胞和小胶质细胞,还包括补体、细胞因子和趋化因子等。研究发现,氧化应激和炎症在AMD发病机制中起着重要的作用,也提供了进一步的理论支持。新生血管生成过程中,血管内皮生长因子已在动物模型中被证实为AMD患者发病过程中的一个关键性因素。动物模型进一步提供了 VEGF的表达和CNV的发展之间的关系。接受过CNV手术的AMD患者的玻璃体标本中,VEGF水平明显增加。研究表明遗传因素也是AMD的主要病因之一,如最近GWAS的研究发现了 19个候选基因,其编码的趋化因子和细胞因子基因多态性与AMD的发生和发展风险相关。包括互补通路相关基因(CFH、CFI、C2/C3)等、脂蛋白(载脂蛋白E基因、CETP、LIPC)、血管生成基因(VEGFA、TGFBR1)、细胞外基质(TIMP3,COL8A1/FILLIP1L)、细胞死亡基因(IER3/DDR1,TNFRSF10A)、葡萄糖和乳酸运输基因(SLC16a8、B3GALTL)、DNA修复基因(RAD51b)、蛋白多糖和血管生成抑制卵裂基因(ADAMTS9/mir548a2)、线粒体基因等。但其具体作用机制目前仍然未知[12]。目前治疗AMD的药物包括VEGF拮抗剂有两类一类是雷珠单抗(Lucentis)、贝伐单抗(Avastin)和阿柏西普(Eylea)。它们均经过玻璃体腔注射;另一类VEGF拮抗剂包括哌加他尼钠单抗(药物Macugen),是由美国食品和药物管理局在2004第一个批准用于湿性AMD治疗的药物。然而,哌加他尼钠单抗与其他三种药物的疗效相比较为有限。虽然VEGF拮抗剂的湿性AMD目前的标准治疗药物,但由于其局限性,这些药物都需要频繁注射,而反复注射高剂量抗VEGF复合物会引起全身性不良反应。其他治疗湿性AMD的眼部并发症的治疗方法还包括光动力治疗,热激光光凝黄斑手术等。此外,抑制补体途径也是湿性AMD潜在的治疗策略之一,但这种治疗手段在治疗干性AMD上还处于临床试验阶段。其他一些治疗方法包括减少氧化应激的药物,治疗靶向补体通路与炎症、视觉周期,神经保护等在干性AMD的临床治疗中也较为常用。其他临床管理方案包括改善生活方式,如戒烟、健康饮食,补充锌和抗氧化维生素(维生素C、维生素E和β-胡萝卜素)等在AMD的治疗中也发挥了重要作用。褪黑素(melatonin,MLT)具有调节人体日常生物节律等多种生理功能,但近年研究表明,MLT还可以调节血压、抗氧化、抗凋亡、保护细胞、避免氧化应激损伤以及免疫调节和抗肿瘤等多领域的生物学作用[167]。此外,MLT还具有镇痛、抗抑郁、抗焦虑、抗惊厥等作用,可以保护中枢神经系统、抗炎症、调节疼痛、降低血压,保护视网膜、血管、抗肿瘤、抗氧化等多种领域发挥生物学作用[168]。在眼科学方面,近年来,人们逐渐认识到,MLT在维持视网膜功能等方面具有重要的作用。作为一种抗氧化剂,MLT能在局部保护光感受器和RPE不受光损伤[169,170]。目前有关AMD发病的危险因素尚不十分明确、临床疗效不满意。在本研究中,我们将分三部分进一步探讨AMD的危险因素以及抗氧化剂MLT对AMD的治疗作用,以期为AMD治疗靶点寻找新的治疗方案。研究目的:探讨并分析年龄相关性黄斑变性(AMD)患者血清褪黑素(MLT)、尿液6-羟基硫酸褪黑素(aMT6s)水平以及二者与AMD危险因素的相关性,并对MLT和aMT6s对RPE细胞保护作用及相关机制影响进行研究。第一部分:年龄相关黄斑变性的危险因素分析方法:(1)自2013年1月至2016年1月进行回顾性研究,本研究共纳入调查资料1万份,然后按照随机数字法则选取58例年龄相关黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)患者为AMD组,同期于我院健康体检中心筛选58例无年龄相关性黄斑变性的成人作为对照组,要求患者年龄及性别比例与AMD组基本一致。收集患者临床资料,并进行统计学分析;(2)入组患者均接受眼底镜检查,并收集眼底镜检查结果,对病程(年)、logMAR-BCVA、视力(°)等指标进行统计学分析;(3)在中国知网、万方及Pubmed等数据库中以关键词AMD进行文献检索,根据既往文献报道的AMD临床症状、体征、实验室检查结果、眼底镜检查,以及多种AMD相关风险因素进行归纳总结,制定问卷调查表。在两名眼科执业医师协助下,患者完成问卷调查并收回问卷。(4)对两组病历资料进行标准问卷调查,包括病人的基本自然状况、既往病史、生活史及专科情况,共计29项。将患者信息填入调查表,应用多元Logistic回归分析法分析各因素与AMD之间的关系。率的比较采用x2检验,计量资料采用x2检验,在单因素分析基础之上进行多因素分析,筛选AMD相关因素。结果:1.参与本研究的患者均签署知情同意书。本研究采用1:1匹配的方法,筛选同期就诊于我院眼视光科及健康体检中心,年龄和性别匹配的AMD患者58例。AMD组中,男30例,女28例;年龄52岁和75岁之间,平均值为(63.4±12.7)岁;病程1个月至2年,平均病程为10.5个月;有27例干性AMD患者和31例湿性AMD患者。其中6眼行PDT治疗,1眼行经瞳孔温热疗法治疗,1眼曾行眼内注射抑新生血管生成药物(AVASTIN)治疗,23例患者曾经接受过手术治疗,最佳矫正视力低于0.1。对照组中,男29例,女29例;年龄50至76岁,平均年龄(63.2±13.3)岁;年龄、性别是两组配比的条件,对此进行均衡性检验,结果显示年龄组(P=0.231>0.05),性别组(P=0.844>0.05)两组比较均无统计学意义,年龄、性别均衡,组间具有可比性。2.AMD组的logMAR-BCVA明显低于对照组,提示在年龄相当的情况下,AMD组的最佳矫正视力通常较对照组为低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.对两组患者黄斑中心凹厚度进行测量及比较,结果发现,在年龄和性别比例匹配的前提下,AMD组的黄斑中心凹厚度明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.在多种危险因素中,吸烟(P<0.001)、总胆固醇(P=0.004<0.05)、甘油三酯(P=0.021<0.05)、低密度脂蛋白(P<0.001)、高血压病(P<0.001)具有统计学意义。5.受教育程度非两项分类,而是用等级分类,对此采用卡方检验,见表1-11结果显示:x2=0.575,P=0.069>0.05差别无显著性,无统计学意义,说明受教育程度并不是AMD的相关因素。进一步对职业性质进行卡方检验,结果表明,P<0.001,说明两组间差别具有显著性,职业是AMD的相关因素之一。6.经显著性检验后,确认6项为AMD的相关危险因素。为进一步探讨相关因素与AMD的相关性,矫正混杂因素。将多种变量纳入多因素分析,最终导入非条件Logistic回归模型。结果表明,吸烟、高血压、光照时间、职业、低密度脂蛋白、总胆固醇具有统计学意义(P<0.05)。第二部分:年龄相关黄斑变性患者外周血MLT与尿液aMT6s表达水平及其相关性分析方法:(1)收集AMD组及对照组的外周血、尿液样品,并使用EDTA抗凝管进行抗凝处理,收集样品后在4℃离心机内离心,留取血清,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测AMD组及对照组血清MLT水平和尿aMT6s水平,并进行统计学分析。(2)对AMD组及对照组血清MLT及aMT6s水平进行Logistic回归分析,并计算OR值;(3)统计学方法:本研究采用SPSS 21.0软件对所收集的数据进行统计学分析。定量数据采用方差分析(ANOVA);定性数据比较采用t检验或x2检验,如数据不满足条件则采用Fisher法计算精确概率,P<0.05认为差别有统计学意义。结果:1.AMD组中,MLT和aMT6s水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.基于对AMD亚组数据的分析发现,性别差异在AMD各种亚型发病率中无明显统计学差异(P>0.05)。3.患者吸烟、心血管疾病、矫正视力低于0.1,MLT和aMT6s水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.通过Logistic回归分析结果发现,MLT和aMT6s水平是AMD发生的独立的危险因素,其中MLT(OR=3.624)和aMT6s(OR=3.201)。第三部分MLT和aMT6s对RPE细胞作用研究方法:(1)MLT和aMT6s预处理RPE细胞(2)MTT测定检测细胞生存率(3)流式细胞仪测定细胞凋亡率(4)细胞内抗氧化酶SOD、GSH和GST水平测定。(5)Western blotting测定胞内与凋亡及氧化应激水平相关蛋白表达结果:1.不同浓度MLT刺激RPE细胞24h后,和对照组(无处理RPE细胞)相比,MLT组的细胞活力明显有所升高。且400μmol/L以上浓度MLT刺激细胞具有统计学意义(P<0.05)。2.不同浓度aMT6s刺激RPE细胞24h后,和对照组(无处理RPE细胞)相比,aMT6s组的细胞活力明显有所升高。且150μmol/L以上浓度aMT6s刺激细胞具有统计学意义(P<0.05)。3.正常RPE细胞核呈均匀弥散荧光。RPE细胞经过MLT和aMT6s处理后细胞的细胞核也呈均匀弥散荧光。与对照组比较,RPE细胞经过MLT和aMT6s处理后均对细胞生长有一定的影响。在MLT和aMT6s作用下,单位面积内细胞数量增加,细胞间隙变小,细胞形态与正常RPE细胞对比无明显差异。4.600μmol/L的MLT和150μmol/LaMT6s处理的RPE细胞,经过流式细胞检测,凋亡率与对照组相比显著下降(P<0.05)。5.和对照组(无处理RPE细胞)相比,MLT组与aMT6s组中的SOD、GST以及GSH水平显著升高,有统计学意义(P<0.05)。6.和对照组(无处理RPE细胞)相比,MLT组与aMT6s组中的Nrf2、p-mTOR、p-Akt以及p-P13K表达水平显著升高,且有统计学意义(P<0.001)。结论:年龄相关性黄斑变性是一种退行性疾病,外周血MLT和尿aMT6s水平改变是AMD发生的危险因素,此外,吸烟史,心血管疾病史,最佳矫正视力水平也是AMD的独立的危险因素。因此,在临床治疗黄斑变性的同时,对以上危险因素进行积极预防,可以明显改善AMD患者的临床表现。