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外泌体指的是磷脂双分子层包裹蛋白质、脂质和核酸等生物大分子形成的功能性囊泡,由多种细胞合成并分泌至血液、尿液、唾液、乳汁、羊水、腹水和脑脊液等,能够广泛调控机体的生理病理过程,是介导细胞间通讯强有力的载体。近期研究提出,奶牛血液及乳中的外泌体内含mi RNA可作为潜在的疾病分子标志物,用于诊断瘤胃酸中毒及乳房炎,但目前国内关于奶牛外泌体的研究鲜有报道。同时,有学者指出乳中外泌体含有丰富的蛋白质,符合食品中活性成分的定义,然而,日粮因素对牛乳外泌体蛋白表达影响的尚不明确。本课题组前期研究表明,非粗料来源纤维(Non-Forage Fiber Sources,NFFS)饲料能够改变荷斯坦奶牛的瘤胃微生物区系,显著降低乙酸/丙酸比例。在此基础上,本研究进一步探索了NFFS日粮引起瘤胃发酵模式改变后对血液潜在分子标志物外泌体mi RNA表达的作用,以及对后续乳中生物活性囊泡外泌体成分的影响。本研究选用12头健康的荷斯坦奶牛,每组6头,随机分为基础日粮组和NFFS日粮组(用5.72%全棉籽和4.73%豆皮替代基础日粮中8.97%的苜蓿干草和2.51%的玉米青贮),使NFFS日粮组粗料来源中性洗涤纤维由20.92%降低至15.67%。预饲期为15天,试验周期为30天,试验结束后采集血液及牛乳。首先利用免疫亲和吸附法提取血液外泌体,并通过纳米颗粒跟踪分析及透射电子显微镜对奶牛血液外泌体进行鉴定,然后利用高通量测序分析NFFS日粮对奶牛血液外泌体mi RNA的影响。其次,利用聚沉法分离牛乳中的外泌体并通过与血液中相同的方法探索NFFS日粮对牛乳中外泌体mi RNA的影响。此外,还通过同位素标记相对和绝对定量技术研究了NFFS日粮对牛乳中外泌体蛋白质的影响。透射电子显微镜及纳米颗粒跟踪分析表明,血液及乳中外泌体呈圆形,外层由生物膜包裹,直径主要分布在40～200 nm。RNA-Seq技术表明牛血清及牛乳外泌体中含有多种小RNA,包括mi RNA、sn RNA、ti RNA、pi RNA、顺式调控元件等,血液外泌体中mi RNA占比约82%,而牛乳外泌体中mi RNA所占比例较低,约22%。血液外泌体中共鉴定出359种mi RNA,与对照组相比,NFFS日粮组bta-mi R-126-5p、bta-mi R-199a-3p、bta-mi R-450b和bta-mi R-500表达显著上调,bta-mi R-2285bc、bta-mi R-2288和bta-mi R-3613a表达显著下调。牛乳外泌体中共鉴定出276种mi RNA,NFFS日粮组bta-mi R-29c、bta-mi R-760-3p、bta-mi R-383和bta-mi R-11973表达显著上调,bta-mi R-10167-3p、bta-mi R-103、bta-mi R-302d、bta-mi R-328、和bta-mi R-885表达显著下调。分别对血液及牛乳前20位高表达的外泌体mi RNA进行功能分析与对比,结果表明血液外泌体约80%的mi RNA与免疫相关;与血液情况相类似,牛乳外泌体约76%的mi RNA与免疫相关。另外,bta-mi R-26a、bta-let-7b、bta-let-7a-5p、bta-mi R-99a-5p、bta-mi R-30d、bta-mi R-191、bta-mi R-151-5p、bta-let-7f、bta-mi R-423-5p、bta-mi R-486和bta-mi R-125b均高表达于奶牛血液和乳外泌体,这些mi RNA的表达量之和分别占血液高表达外泌体mi RNA的64%及牛乳高表达外泌体mi RNA的71%,推测牛乳中部分外泌体mi RNA可能来源于血液传递。本研究在牛乳外泌体中共鉴定出488种蛋白,与对照组相比,NFFS日粮组40种蛋白表达显著下调,25种蛋白表达显著上调。差异表达蛋白的功能主要富集于补体和凝血级联反应、趋化因子信号通路、吞噬和抵抗细菌感染过程。另外,本研究中鉴定出57个在不同物种和体液中稳定高表达的蛋白,其种类主要为酶及酶调节剂、细胞骨架和转运相关蛋白,这些蛋白可能与外泌体的产生,结构和转运密切相关,体现了外泌体的共有属性,不受物种及来源细胞的影响。本研究成功分离鉴定出荷斯坦奶牛血液及乳中外泌体,并分析了其内含mi RNA及蛋白质表达特性,从外泌体角度揭示了牛乳的免疫机制,为后续奶牛外泌体相关研究提供了一套完整的工作流程参考。另外,本研究发现奶牛血液及乳中外泌体mi RNA均可受NFFS日粮影响,提示在选择外泌体mi RNA作为疾病诊断标志物时不能忽略日粮因素带来的影响。本研究为拓宽奶牛疾病诊断标志物提供了科学依据,并丰富了现有的乳中生物活性成分信息库。