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黑麦属(Secale L.,染色体组为RR,2n=14)属于小麦族(Triticeae),是小麦(Triticum aestivum L.,染色体组为AABBDD,2n=42)的近缘属植物,在小麦育种中发挥了重要的作用,是提高普通小麦产量,改良普通小麦品质、抗病性和抗逆性的重要种质资源。研究表明75Kγ-secalins基因位点(Sec2位点)可能与小麦籽粒产量的提高及成熟种子中蛋白质含量的增加有关,同时Sec2位点的编码产物对面粉的加工品质也有影响。
本文通过对秦岭黑麦及普通小麦与秦岭黑麦杂交后代F3杂种、稳定品系YYW89(F7)和YYW102(F7)进行SDS-PAGE分析,并对75Kγ-secalins亚基编码基因进行克隆、测序、结构分析及序列比对,获得的主要结果如下:
1.以秦岭黑麦作为对照,采用SDS-PAGE方法分析鉴定出F3杂种、YYW89(F7)和YYW02(F7)均表达了一条75Kγ-secalins亚基带,表明75Kγ-secalins基因转递到了杂交后代,表明稳定品系YYW89(F7)和YYW102(F7)具有黑麦的2R染色体。
2.设计特异引物(SecF/SecR)扩增秦岭黑麦、F3杂种、YYW89(F7)和YYW102(F7)的75Kγ-secalins亚基基因,将阳性克隆送样测序,分别得到12个、11个、15个和22个共59个75Kγ-secalins基因编码序列,大小介于609bp-1440bp之间,其中在F3杂种和YYW89中均克隆得到了1440bp的HQ266678(NCBI登录号)。该结果表明Sec2位点是一个多基因家族。序列分析发现有7个假基因,其中6个是由于C→T的点突变导致提前出现终止密码子TAG/TAA,另一个是移码突变所致。
3.对推导的氨基酸序列分析表明,这些亚基序列长度的区别是重复区域连续的大片段缺失或者插入,同时存在碱基替换,保守的信号肽序列也存在碱基替换。我们在其中4个亚基的重复序列中发现了一个额外的半胱氨酸残基(Cys),而在另外2个亚基中发现由于一个T→C点突变的出现导致C-末端一个半胱氨酸残基(Cys)被精氨酸残基(Arg)所替换。
4.通过基因碱基序列的比对我们在HQ266699序列中发现了一个95bp插入片段,序列分析表明在HQ266699中有两个特别的重复序列,可能由于unequalcrossing over(不等交换)产生。