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DNA甲基化在植物生长发育和干旱等逆境胁迫适应性中具有重要作用,同时也是基因组潜在的变异来源。植物中,通过群体遗传学研究已鉴定出调控开花等复杂性状的DNA甲基化位点,但目前尚缺乏有效手段对序列特异位点DNA甲基化状态进行精准操作,极大限制了对这些位点进一步的功能研究与利用。本研究通过将CRISPR-dCas9蛋白与具有DNA去甲基化功能的ROS1蛋白融合,形成靶向特异序列的DNA去甲基化系统,进一步通过构建噬菌体衣壳蛋白二聚体（MS2）与ROS1融合蛋白,并设计具有特异发卡结构能够结合MS2的g RNA位点,以提高该系统DNA去甲基化效率,分别在拟南芥和玉米原生质体中靶向DNA甲基化特异位点,主要研究结果如下:1.为了检测基于dCas9-ros1系统DNA去甲基化编辑效率,选取拟南芥中FWA基因的启动子高甲基化区域作为靶标,在拟南芥的原生质体中对载体进行瞬时表达。通过对转化后的目标序列进行重亚硫酸盐转化后的目标区域扩增测序（BS测序）,检测到目标区域DNA甲基化水平显著降低,证明了dCas9-ros1系统具有靶向DNA去甲基化的作用。2.参考前期在拟南芥epiRIL群体中检测到位于SKP1 INTERACTING PARTNER 3（SKIP3,AT2G02350）基因启动子上DNA甲基化水平与拟南芥开花时间显著相关,因此,选取该高甲基化位点作为靶点,利用农杆菌介导的花序浸染法将构建的CRISPR/dCas9-ros1-SKIP3载体在拟南芥植株中进行稳定表达。在转基因阳性植株中,靶标位点DNA甲基化显著降低,同时对应基因SKIP3表达显著上调。随机选择6个拟南芥中基因启动子区域存在DNA甲基化修饰的基因作为对照,发现这些基因在转基因植株中表达量与其在野生型拟南芥植株中表达差异不显著,证明dCas9-ros1 DNA甲基化编辑系统能够有效编辑靶标位点,且具有一定专一性。通过对拟南芥转基因阳性植株进行表型鉴定发现,随着SKIP3启动子DNA甲基化水平降低,植株开花期显著延迟,且莲座叶片数增加。为了进一步阐明SKIP3如何影响植株开花,我们对开花相关基因Flower locus C（FLC）、CONSTANS（CO）、Frigida（FRI）、Circadian clock associated 1（CCA1）、Flower locus K homology domain（FLK）、Flavin-binding kelch repeat F-box 1（FKF）、Zeitlupe（ZTL）等在转基因植株中表达量进行分析发现,转基因植株中FLC表达量显著增高,且在不同转基因株系中表达量增加趋势与靶标基因SKIP3一致,推测SKIP3表达量增加从而影响开花期可能是通过FLC调控的开花途径完成。3.课题组前期研究通过对玉米耐旱性自交系AC7643和干旱敏感自交系AC7729/TZSRW进行Me DIP全基因组DNA甲基化测序,筛选出不同耐旱性自交系DNA甲基化差异位点Chr8:176652465-176652814（候选位点8.176）。通过BS扩增测序发现,在PEG模拟干旱胁迫下玉米苗期植株中该区域DNA甲基化水平显著降低,其中干旱敏感自交系AC7729/TZSRW中DNA甲基化水平显著高于耐旱自交系AC7643。选择该位点作为g RNA靶标,构建CRISPR/dCas9-ros1-8.176载体并在玉米自交系CO1原生质体中进行遗传转化。瞬时表达CRISPR/dCas9-ros1-8.176导致目标区域DNA甲基化水平显著降低,其对应基因细胞周期蛋白（Zm00001d012560）表达量显著增高。该结果进一步表明,CRISPR/dCas9-ros1系统能够同时在分别以拟南芥、玉米为代表的双子叶、单子叶植物中对特定靶位点进行DNA甲基化水平修饰。4.在由200份玉米自交系构建的关联群体中,分别利用一般线性模型、混合线性模型和贝叶斯推断,将群体DNA甲基化水平作为基因型,与苗期干旱胁迫后植株存活率进行全基因组关联分析,筛选到位于染色体Chr1微管相关蛋白（Microtubule-associated protein 65,MAP65）自然反义转录本NATMAP65上的epi MAP位点DNA甲基化水平与干旱胁迫下植株存活率和根干重等性状显著相关。植株DNA甲基化水平越高,对应自交系在苗期干旱胁迫下植株存活率越低、根分枝数越少。在由耐旱性自交系AC7643和干旱敏感自交系AC7729/TZSRW构建的RIL群体中,干旱胁迫下苗期根系干重、总根长在NATMAP65高表达自交系与低表达自交系间存在显著差异。干旱胁迫下,DNA甲基化水平与NATMAP65表达量变化趋势相反。基于Fickett算法,对MAP对应转录本转录本序列进行蛋白编码潜能分析,Fickett得分为0.45,显著低于可编码蛋白序列平均得分（0.74）;结合前期RIL群体亲本Ribosome profiling测序的reads在该转录本区域并无分布,因此推测NATMAP65为lncRNA。基于epi MAP位点序列设计特异g RNA,并在玉米原生质体中进行瞬时表达发现,DNA甲基化水平的降低,促进NATMAP65的表达。