弓形虫是一种分布广泛的机会致病原虫,寄生于包括人类在内的几乎所有温血动物的有核细胞内。该虫是一种广泛分布的顶复门寄生原虫,具有广泛的宿主群,呈世界性分布,人和许多动物均可感染,引起人畜共患弓形虫病。弓形虫属机会致病原虫,孕妇和免疫功能低下者感染弓形虫可造成严重危害。近年来,随着宠物饲养爱好者及肿瘤患者、AIDS病人等免疫功能低下人群的逐渐增多,弓形虫的危害也日益凸显。弓形虫发育过程形态多样,生活史复杂,可分为有性生殖和无性生殖两个阶段,生活史中速殖子和缓殖子(包囊)是其主要的传播和致病阶段。其中无性生殖的速殖子阶段危害较为严重。当速殖子进入宿主脑内就会形成包囊引起慢性感染,弓形虫的慢性感染占人类弓形虫感染的绝大部分,也是最主要的表现形式,慢性弓形虫感染会引起中枢神经系统损伤。目前,已知弓形虫仅有一个种,但存在着不同的基因型。除典型的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型外还有至少138个非典型基因型。世界范围内,弓形虫基因型的分布具有地域性。通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP),多位点酶电泳(MLEE)、微卫星分析等技术将弓形虫分为三个主要的谱系,分别为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。除此以外还有一些特殊的非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型基因型,被定义为非典型基因型。它们在DNA序列上仅有1%-2%的微小差别,但毒力却存在很大差异。Ⅰ型属于强毒株(如RH株),致病性很强,输注1个速殖子就能引起小鼠死亡,产生高度虫血症,与急性期感染相关。Ⅱ、Ⅲ型属于弱毒株(如CEP株),对小鼠的致死剂量超过1000,Ⅱ型与慢性感染有关。通过对弓形虫进行基因分析可以发现不同地区的弓形虫分离株在遗传上有不同的多样性,基因型的不同导致虫体的致病力及对药物的敏感性存在差异。对弓形虫的基因进行分析,可以为弓形虫病的诊断和治疗提供依据。本实验通过采集云南大理HIV阳性者的血液,对全血样本进行基因提取,运用巢式PCR和RFLP等技术分析,与弓形虫国际标准株进行比对,对云南大理HIV阳性者感染弓形虫的SAG1、c22-8基因位点进行初步分析,为发病机制和感染免疫的深入研究及临床治疗提供依据。1. 研究目的1.1 初步了解云南大理HIV阳性者弓形虫感染情况。1.2 初步对云南大理HIV阳性者感染弓形虫SAG1、c22-8基因进行分析,为进一步的分子遗传学研究以及弓形虫病的防制提供资料。2. 研究方法2.1 样本收集收集云南省大理市艾滋病防治机构的HIV阳性者血液样本291份,均经蛋白印迹(WB)试验阳性确证。2.2 弓形虫基因提取及扩增、回收、纯化采用全血基因提取试剂盒对HIV阳性者弓形虫血液样本进行基因提取,引用国际上成熟的引物及巢氏PCR技术对弓形虫SAG1、c22-8基因进行扩增,经两轮扩增后电泳,全自动凝胶成像分析系统进行分析。对弓形虫SAG1、c22-8基因扩增阳性的样本,用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。2.3 酶切弓形虫SAG1基因扩增阳性产物用限制性内切酶Sau96I和HaeⅡ, c22-8基因扩增阳性产物用限制性内切酶BsmAI和MboⅡ酶切,酶切后电泳结果与弓形虫标准株进行比对,对云南大理HIV阳性者感染的弓形虫进行基因的初步分析。2.4 测序弓形虫SAG1和c22-8基因扩增阳性样本回收后送至上海立菲公司进行测序。测序结果采用DNAStar软件系统进行分析,并与GenBank注册的弓形虫RH株的SAG1和c22-8进行比对分析。3. 结果3.1 本次共检测291份血液样本,其中弓形虫SAG1基因成功扩增64份,c22-8基因成功扩增32份；SAG1基因分子生物学检测阳性率为22.0%,c22-8基因分子生物学检测阳性率为11.0%。3.2 云南大理HIV阳性者全血样本291份,经过基因抽提和巢氏PCR对弓形虫SAG1、c22-8基因进行扩增后用2.5%的琼脂糖凝胶电泳,并采集图样。其中SAG1基因成功扩增64份,扩增的目的条带片段为390bp；c22-8基因成功扩增32份,扩增的目的条带片段为521bp。3.3 64份SAG1基因扩增阳性的产物经Sau96I和HaeⅡ酶切后电泳,均可见2个条带,分别约为350bp和50bp；32份c22-8基因扩增阳性产物用限制性内切酶BsmAI和MboⅡ酶切后电泳,均可见3个条带,分别约为120bp、240bp和20bp；与标准基因工型株(RH株)相一致。3.4 选择样本扩增阳性的弓形虫 SAG1、c22-8基因进行序列测定后,与Genbank上注册的弓形虫SAG1、c22-8基因(登录号为GQ253073.1、AM055943.1)序列进行比对,发现上述基因的碱基对之间存在少量的转换和缺失。4. 结论4.1 采用巢式PCR从云南大理HIV阳性者感染弓形虫的全血标本中成功扩增出SAG1基因64份,阳性率为22.0%；c22-8基因32份,阳性率为11.0%；SAG1基因位点检测阳性率高于c22-8。4.2 云南大理HIV阳性者感染弓形虫株酶切结果与国际标准基因I型株(RH株)一致。4.3 云南大理HIV阳性者感染的弓形虫SAG1、c22-8基因扩增阳性样本的测序结果显示,弓形虫SAG1、c22-8基因与Genbank上注册的弓形虫RH株基因的碱基对之间的差异率非常小,表现为碱基对的转换和缺失。4.4 云南大理HIV阳性者感染的弓形虫是否还存在与国际标准基因工型株(RH株)不一致的情况,还有待进一步研究。5. 本实验研究的创新点本实验主要有以下三个方面的创新点：5.1 本实验选择云南大理地区,该地域辽阔,资源丰富,气候宜人且是以白族为主的多民族聚集地,初步了解了云南大理HIV阳性者感染弓形虫遗传多态性特点,具有明显的地方特色。5,2 以弓形虫高危人群(云南大理HIV阳性者)为研究对象,初步对云南大理HIV阳性者感染弓形虫SAC1、c22-8基因进行分析。5.3 本实验直接从HIV阳性者全血样本中提取弓形虫基因并成功扩增出弓形虫SAG1基因、c22-8基因。