论文部分内容阅读
流行性感冒病毒,简称流感病毒,属正粘病毒科(Orthomyxo viridae),其为有包膜的单负链RNA病毒,其基因组分为8个节段。根据流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原性的差异可划分为甲(A)、乙(B)和丙(C)三型。乙型流行性感冒病毒虽然没有像甲型流感病毒一样引起过人群内的大流行,但是能通过抗原漂移,产生新的病毒,每年能引起世界范围内的季节性流行,严重威胁人类的健康和生命安全。因此,季节性流感疫苗由A (H1N1)、A (H3N2)和乙型病毒共同组成生产毒株。目前已上市的季节性流感疫苗主要有三类：裂解疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗。流感减毒活疫苗采取滴鼻方式进行接种,模拟病毒自然感染的途径在呼吸道粘膜诱导产生免疫应答,免疫保护性好。目前上市的流感减毒活疫苗,都以鸡胚作为基质生产。使用鸡胚生产活疫苗,由于缺乏病毒灭活的手段,存在传播鸡源病原体的风险。此外,鸡胚较长的供应周期制约着疫苗生产,尤其是突然爆发高致病性流感时,疫苗生产难于满足应对流感大流行的需要。Vero细胞是WHO推荐用于生产人用生物制品的细胞基质,可采用发酵罐大规模培养病毒。相对于鸡胚培养,细胞培养病毒抗原变异小,更接近原始分离病毒。但Vero细胞不是培养流感病毒最敏感的基质,不同毒株间产毒量差异较大,甚或不能生长复制。目前全球尚无以Vero细胞为基质生产的季节性流感病毒减毒活疫苗面市。我们经过10多年的研究,在国际上率先成功选育出一株乙型流感病毒Vero细胞冷适应株B/Yunnan/23/2011 Vca (BVca)。本研究以BVca作为母本毒株,与WHO推荐的乙型流感病毒流行株B/Brisbane/60/2008 NYMC BX-35 (BX-35)遗传重配,以解决Vero细胞乙型流感病毒减毒疫苗生产毒株制备的瓶颈技术。试验研究中,使用Vero细胞冷适应株BVca与流行株BX-35共感染Vero细胞,在重配病毒中加入抗BVca血清中和带有母本株表面抗原HA和NA的子代病毒,经蚀斑纯化获得带有BX-35的表面抗原的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株BX-35Vca。该病毒在Vero细胞上25℃培养,感染性滴度不低于1×107TCID50/ml,具有温度敏感性(ts)、冷适应性(ca)和减毒(att)表型。在Vero细胞连续传代20代,HA、NA氨基酸没有发生变异。制备的减毒活疫苗滴鼻免疫小鼠能够抵抗致死剂量的同系乙型流感病毒的感染。本研究首次证实BVca可作为母本毒株,采用遗传重配技术制备Vero细胞乙型流感病毒减毒疫苗生产用毒株。