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目的:本研究采用氢化可的松(Hydrocortisone,HC)建立糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)诱导的免疫抑制小鼠模型,研究青蒿琥酯(Artesunate,AS)对HC诱导的免疫抑制小鼠模型的保护作用及其分子机制。方法:1.通过连续5天肌肉注射不同剂量的HC(5、10、20 mg/kg)建立HC诱导的免疫抑制小鼠模型,于第6天腹腔注射1.0×10~8 CFU/Kg的大肠埃希菌,通过观察小鼠7天死亡率、血清TNF-α水平、脾脏指数和胸腺指数来选择HC造模剂量。为进一步观察模型小鼠清除细菌的能力,采用最佳剂量的HC建立免疫抑制模型,然后腹腔注射不同剂量的大肠埃希菌(1.0×10~7、5.0×10~7、1.0×10~8 CFU/Kg),通过检测小鼠血清TNF-α水平、血液细菌数量来评价模型小鼠清除细菌的能力。2.采用上述方法建立HC诱导的免疫抑制小鼠模型,在首次注射HC的同时腹腔注射AS(20 mg/kg),2次/天,在HC停止给予后继续给予AS 1~5天;在结束HC给予后的第1~5天分别腹腔注射5.0×10~7 CFU/Kg大肠埃希菌,通过检测小鼠脾脏指数、血清TNF-α、IL-6水平来评价AS不同给予时间对小鼠的影响。在此基础上,将小鼠分为Control组、模型组、AS组、Th组、AS+Th组。分别给予AS腹腔注射(20 mg/kg),2次/天;Th肌肉注射(10 mg/kg),1次/天;给药结束后腹腔注射大肠埃希菌(5.0×10~7 CFU/Kg)6 h后处死动物,通过检测小鼠血液中细菌数量,血清TNF-α、IL-6水平,肠道分泌型免疫球蛋白(sIgA)含量,血液里白细胞(WBC)数量来评价AS保护作用。3.HC免疫抑制细胞模型的建立:分离并培养小鼠腹腔巨噬细胞,加入不同浓度的HC预处理0.5 h后再加入100 ng/mL LPS,根据细胞上清中TNF-α释放情况选择建立合适的建立HC诱导的免疫抑制细胞模型。此后,在HC诱导的免疫抑制细胞模型中,加入不同浓度AS或在不同时相点加入AS,根据细胞上清中TNF-α水平选择的AS给药浓度和给药时间,确定AS给药方案。根据最佳给药方案处理HC细胞后加入LPS,通过检测细胞上清中TNF-α、IL-6水平及其mRNA表达情况,评价AS的作用。收集细胞,采用PCR技术检测AS对HC细胞中糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(Glucocorticoid-induced leucine zipper,GILZ)mRNA、TLR4、NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA表达的影响;采用ELISA法检测AS对细胞总蛋白中NF-κB p65、胞浆蛋白NF-κB p65活化的影响。结果:1.随着HC剂量增大,HC给药小鼠与对照组相比,其脾脏指数逐渐减少;接受大肠埃希菌攻击后存活率逐渐降低,TNF-α水平逐渐减低。因此,选择20 mg/kg的HC剂量,连续5天注射、1次/天能建立HC诱导的免疫抑制小鼠模型。而且,随着大肠埃希菌攻击剂量的增加,小鼠血液中大肠埃希菌载荷量明显增多、TNF-α水平降低,其清除细菌能力明显降低,并呈一定的量效关系。2、AS对HC诱导的免疫抑制小鼠模型的保护作用(1).AS保护作用的确定:AS能够增加免疫抑制小鼠脾脏指数,增加血液中TNF-α、IL-6水平,其中AS 2增加炎症因子水平最显著。(2).AS能够增强小鼠清除细菌能力,增加小鼠血清中TNF-α、IL-6含量,增加小鼠血液里白细胞数量,增加肠道分泌型免疫球蛋白含量,对HC诱导的免疫抑制小鼠的体现出保护作用,与Th联合使用后保护效果最为明显。3、AS免疫调节作用机制的初步研究。(1)采用HC 0.5μg/mL预处理0.5 h后再用100 ng/mL LPS处理细胞建立免疫抑制模型,模型细胞TNF-α释放较100 ng/mL LPS处理组细胞明显减少。(2)AS增加HC模型细胞TNF-α及IL-6的释放;(3)AS可增加免疫抑制模型细胞中TLR4、NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA表达及NF-κB p65蛋白活化,减少GILZ mRNA表达。结论:采用连续5 d肌肉注射HC(20 mg/kg)成功建立HC诱导的免疫抑制小鼠模型,AS对HC诱导的免疫抑制小鼠具有显著的保护作用,能提高小鼠清除细菌能力、提高血液中TNF-α、IL-6水平。采用HC 0.5μg/ml诱导的小鼠腹腔巨噬细胞免疫抑制细胞模型,AS可显著提高HC诱导的免疫抑制细胞释放TNF-α、IL-6能力,该作用与其可能与抑制GILZ mRNA高表达和上调TLR4/NF-κB通路密切相关。