2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）作为L-抗坏血酸（L-ascorbic-acid,L-AA）的衍生物,由于其相较于L-AA拥有更好的抗氧化性能,并且在体内能在α-葡萄糖苷酶作用下重新分解为L-AA与D-葡萄糖,从而发挥出L-AA的生理活性作用,因此是目前为止L-抗坏血酸的一种最佳替代品。而正是AA-2G拥有这些优良的理化性质,使得其在食品、饲料、医疗药品和化妆品等行业有着广泛的应用。AA-2G的合成分为化学合成和生物合成两种方法,但是化学法存在生产成本高、操作过程复杂等劣势,使得生物酶法成为合成AA-2G的主流方式。在生物酶法合成AA-2G的5种酶中,环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）,由于其较高的底物特异性以及较高的合成产量,通常被认为是合成AA-2G最高效的酶。因此,通过CGTase酶法合成AA-2G成为当前的一个研究热点。在本研究中,将来源于马里亚纳海沟海洋微生物宏基因组测序获得的能够编码环糊精葡萄基转移酶的my20基因经人工合成后连接到质粒pET-24a中,成功实现了E.coli BL21（DE3）的高效异源表达,同时也开展了酶法制备AA-2G的初步应用试验。以下就是本论文的主要研究结果:为提高重组CGTase在E.coli BL21（DE3）的表达量,通过优化实验对诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度等发酵条件进行优化。实验结果表明,当诱导时间为18h时,重组CGTase环化活力最高。诱导时间过长,重组酶环化活力会逐渐降低,而这可能与细胞死亡以及蛋白自身降解有关。当诱导剂（IPTG）浓度为0.4 mM时,重组酶环化活力最高。虽然表达载体pET-24a受IPTG强烈诱导,但是过高的IPTG浓度,一方面会导致重组蛋白翻译过快,不能正确折叠,从而导致包涵体的形成,另一方面过高浓度IPTG的积累也会对细胞产生毒害作用。当诱导温度为20℃时,重组酶环化活力最高。诱导温度会影响重组蛋白的正确折叠以及包涵体的形成,当诱导温度过高时,重组蛋白在细胞体内聚集过多,可溶性蛋白的量减少。因此,最终确定在细胞OD600值达到0.6-0.8,添加0.4 mM的IPTG,于20℃条件下诱导18h,重组CGTase的环化活力达到最高。将粗酶液用镍柱进行纯化,通过SDS-PAGE电泳检测到纯化酶液达到电泳纯,且CGTase分子量与理论分子量75KDa相一致。通过镍柱纯化后,该酶比活力由0.94 U/mg上升到63.3 U/mg,纯化倍数为67.3,回收率为43.7%。当以可溶性淀粉作为底物时,该重组酶最适反应温度为80℃,且该重组CGTase拥有较好的耐热性,在10℃-80℃环境下放置2 h后,其环化活力几乎没有变化。最适反应pH为7,且该酶在较广泛的pH范围内依然能保持较高的酶活性。通过对该重组酶酶学性质的探究,该重组酶较现如今报道的大多数CGTase拥有较好的热稳定以及pH稳定性。当应用于工业化生产时,能够延长重组酶的工作时间,减少污染的风险,此外还能够增加反应体系的温度,进一步增加反应底物的浓度,因此该重组酶在工业化生产AA-2G,环糊精方面有潜在的应用价值。K+、Mg2+、Li+、Ba2+和Mn2+对重组酶活性几乎没有影响,而Fe2+、Cu2+抑制酶活性,Ca2+以及化学试剂EDTA能够提高酶活性。通过Hanes-Woolf作图法,在最适反应温度下计算Km为5.1 g/L,Vmax为0.65μmol/L·min。由于该重组酶较好的理化性质,使得该重组CGTase在工业上有潜在的应用价值。以α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精以及可溶性淀粉作为供体底物合成AA-2G时,α-环糊精的产量最高,β-环糊精的产量次之,可溶性淀粉的产量最少。但是考虑到α-环糊精价格昂贵,并不适用于工业化生产AA-2G。因此,选择β-环糊精作为后续实验的供体底物。在本研究中,为进一步提高该重组酶催化合成AA-2G的产量,以β-CD,L-AA分别作为供体底物与受体底物,对时间、温度、pH、底物浓度、酶浓度等条件进行了单因素优化实验,提高AA-2G的产量。实验结果表明当反应时间为24 h,反应温度40℃,反应pH 4,底物浓度50 g/Lβ-CD,酶浓度75 U/gβ-CD时,该重组CGTase转化合成AA-2G的含量最高,最高浓度能达到28g/L,且AA-2G产量要优于目前报道的大多数CGTase合成AA-2G的产量。