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鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus, DHAV)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,基因组RNA编码结构蛋白和非结构蛋白。其中,结构蛋白对病毒的组装和致病性有重要作用。VP3蛋白是主要的结构蛋白,位于衣壳表面,相对保守,是病毒粒子抗原性的主要决定因子,存在着众多抗原表位,可诱导机体产生免疫应答。1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)是分布最广、危害最大的DHAV,本研究对DHAV-1的VP3进行原核表达和纯化,并制备兔抗VP3多克隆抗体,通过鸡胚中和试验探究VP3多抗血清的中和活性；通过间接ELISA对VP3上可能存在的B抗原表位进行鉴定；建立基于VP3的检测DHAV抗体的间接ELISA方法。1. DHAV-1 VP3的原核表达、纯化及鉴定通过RT-PCR得到了预期大小的VP3片段,将目的片段先后T-A克隆至pMD19-T (simple)和亚克隆至pGEX-4T-1,分别构建了重组T质粒pMD19-VP3和重组表达质粒pGEX-VP3。 pGEX-VP3转化BL21(DE3)后表达的重组蛋白约50kD。以0.2mmol/LIPTG、37℃诱导8h表达量最大,且始终以包涵体形式表达。采用切胶纯化获得的重组蛋白纯度高。Western blot表明重组蛋白可被兔抗DHAV-1抗体识别,具有良好的反应原性。2. DHAV-1 VP3的抗血清中和活性分析及B细胞表位鉴定利用纯化的VP3重组蛋白乳剂免疫雄兔,经五免后琼脂扩散试验的效价均达到1：16。Western blot证明兔抗血清可与VP3蛋白特异性结合。鸡胚中和试验表明VP3抗血清的中和效价为2-5.29。运用生物信息学软件综合分析VP3序列的柔韧性、表面可及性、亲水性和抗原性,预测出四条B细胞表位多肽送公司合成。以制备的VP3多克隆抗体作一抗,VP3蛋白作抗原进行间接ELISA,确定了表位肽的最佳稀释度为1：1280,然后以该浓度稀释的表位肽作抗原进行间接ELISA鉴定B细胞表位,结果证明1GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP20、 131FNTGRYQMSWYPIADGEQSL150和200VNSSAPSNID209能与VP3多克隆抗体特异性结合,为VP3的B细胞表位。进一步用DHAV-1临床鸭血清样品对B表位的抗体检测能力进行评估,结果表明表位肽可用于检测DHAV-1抗体。3.基于DHAV-1 VP3蛋白的间接ELISA方法的建立通过条件的摸索,得到以VP3作为包被抗原的间接ELISA方法的最佳检测条件为：以9.375 ng/μL蛋白浓度4℃包被过夜,1%明胶37±封闭90min,加1：160稀释的被检血清于37±孵育90min,1：2000稀释的HRP标记兔抗鸭IgG于37±孵育45min。确定了阳性阈值为0.332。该方法有良好的敏感性、重复性及特异性,并能同时检测出DHAV-1和DHAV-3的抗体,与DHAV-1全病毒作抗原的间接ELISA方法的符合率为96%。