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目的：在本研究中,将用PCR法从小鼠10.5d胚胎cDNA文库中扩增出的Dnd1基因引入慢病毒载体系统,并生产Dnd1慢病毒颗粒。为进一步明确Dnd1体外生物学功能奠定基础。方法：1.Dnd1基因的获得根据GenBank中小鼠Dnd1基因序列(BC034897),使用DNAstar软件设计基因的特异引物Dnd1-Age IF和Dnd1-AgeI-R,并且引入Age I酶切位点。用PCR法从小鼠10.5d胚胎cDNA文库中扩增出Dndl基因。PCR法筛选阳性克隆。2.重组慢病毒载体转移质粒pGC-FU-Dndl的构建采用In-Fusion技术,将Age I酶切回收后的PCR产物交换连接入Age I酶切的pGC-FU真核表达载体,产生pGC-FU-Dnd1质粒。连接产物质粒转化大肠杆菌E.coli DH5a感受态细胞,扩增质粒。3连接产物pGC-FU-Dnd1的酶切鉴定收集部分扩增后连接产物质粒,酶切后经电泳证实所得片段长度均与预期相符,说明Dnd1基因已克隆成功。基因测序结果亦证实成功克隆Dnd1基因。4连接产物pGC-FU-Dnd1质粒转染293T细胞用脂质体Lipofectamine 2000包裹构建的pGC-FU-dnd1和辅助包装载体,共转染293T细胞,产生含有表达Dnd1蛋白的Lentivirus病毒颗粒。结果：1成功获得Dnd1目的基因片段。通过PCR筛选得到Dnd1目的基因片段。2连接产物pGC-FU-Dnd1的测序结果与GenBank中dnd1基因序列(BC034897)比较,表明Dnd1基因序列及读码框均正确。3三质粒转染293 T细胞后荧光显微镜观察结果及Western-blot检测鉴定表明成功建立Dnd1慢病毒表达载体系统。结论：1成功克隆小鼠Dndl基因和成功构建pGC-FU-Dnd1质粒2 pGC-FU-Dnd1表达载体经过转染293T细胞,48小时后观察到绿色荧光蛋白的表达；经Western bloting检测到Dnd1蛋白在293T细胞中的表达,从而证明我们成功建立了Dnd1重组慢病毒,对其进行纯化后采用逐孔稀释法测定滴度,滴度测定结果为2E+9TU/ml。这为更深入的探讨Dnd1基因抑制细胞增殖中等体外细胞生物学功能提供实验基础。