丙烯酰胺慢性暴露对黑质--纹状体的影响及神经炎症介导的机制研究

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丙烯酰胺(Acylamide, ACR)是美拉德反应的副产物,在各类食品中广泛存在,具有神经毒性但机制未完全阐明。本研究运用体内整体动物观察性研究和体外细胞干预性研究相结合的方法,从神经行为学、病理学和分子生物学角度,研究ACR长期暴露对黑质和纹状体的影响及神经炎症介导的潜在机制,旨在进一步丰富和深化ACR神经毒作用理论,并为寻找ACR毒性防治方式提供新方向。
  第一部分丙烯酰胺慢性暴露对黑质-纹状体的影响
  目的:观察ACR慢性暴露对大鼠神经行为、黑质与纹状体神经元与神经胶质细胞及神经炎症的影响。
  方法:SPF级雄性SD大鼠36只,随机分为3组,分别为对照组、0.5mg/kg/dayACR组、5mg/kg/dayACR组,每组12只,连续饮水暴露12个月,每周称量体重、评分步态。暴露末进行旷场实验、平衡木实验、旋转加速实验、后肢撑力测定实验。暴露结束,处死所有动物,称量脏器计算脏器系数,血清检测评价大鼠氧化应激及炎症水平。HE和尼氏染色观察黑质和纹状体中神经元结构变化,透射电镜观察黑质超微结构改变,流式细胞术检测神经元凋亡率,免疫组化、免疫荧光染色或westernblot方法检测神经损伤及炎症指标的分布和表达。
  结果:⑴ACR对大鼠整体毒性和神经行为学的影响。①整体毒性评价。与对照组比,低剂量组大鼠表现无明显异常,血清氧化应激和炎症因子指标均无明显变化(P>0.05);5mg/kg组大鼠从暴露第六个月起开始出现脱毛、嗜睡、少动等症状,血清丙二醛(MDA)、促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)及抑炎因子IL-10含量均明显升高(P<0.01)。各组大鼠体重、饮水量、脏器系数均无明显差异(P>0.05)。②神经行为学变化。与对照组比,0.5mg/kg组大鼠运动平衡指标均无明显改变(P>0.05);5mg/kg组大鼠从暴露第7个月开始步态评分明显升高(P<0.001),暴露结束时大鼠后肢撑力指数、运动平衡能力评分明显升高,总运动距离和中心区域运动距离、转棒上的停留时间均明显缩短(P<0.001)。
  ⑵ACR对大鼠黑质纹状体神经元的影响。与对照组比,0.5mg/kg组大鼠黑质纹状体神经元结构无异常,酪氨酸羟化酶(TH)及α-突触核蛋白(α-Syn)的分布和表达均无明显差异(P>0.05),但NeuN表达明显减少(P<0.05),黑质中P-TH(Ser40)表达明显减少、基质金属蛋白酶3(MMP3)表达明显升高(P<0.01);5mg/kg组黑质神经元有明显的核固缩,尼氏体数量减少、淡染,神经元凋亡率、Bax/Bcl-2值明显升高(P<0.001),黑质和纹状体中α-Syn分布及表达、MMP3表达显著升高,TH、P-TH(Ser40)、NeuN、BDNF、SYN1、SYP表达均明显减少(P<0.05)。
  ⑶ACR对黑质纹状体神经胶质细胞的影响。①促进小胶质细胞和星形胶质细胞的增生。与对照组比,低剂量组黑质中Iba-1+细胞数明显增加(P<0.05),纹状体GFAP+细胞数、Iba-1+细胞数及蛋白表达均无明显变化(P>0.05);5mg/kg组黑质和纹状体Iba-1+细胞数和蛋白表达均明显升高(P<0.01),黑质GFAP+细胞数明显增加(P<0.05)。②促进小胶质细胞的激活。与对照组相比,0.5mg/kg组黑质和纹状体中分枝状和阿米巴样小胶质细胞的比例、Iba-1+CD68+细胞数均无明显变化(P>0.05);5mg/kg组黑质、纹状体中分枝状小胶质细胞的比例显著减少,阿米巴样小胶质细胞的比例明显升高(P<0.001),Iba-1+CD68+细胞数量均明显增加(P<0.001)。
  ⑷ACR对炎症因子及其信号通路的影响。①对炎症因子的影响。与对照组比,0.5mg/kg组黑质及纹状体中Pro-IL-1β、IL-1β、TNF-α、IL-6、Cox-2表达无明显改变(P>0.05);5mg/kg组黑质和纹状体中以上蛋白的表达均明显上升(P<0.05)。荧光共染显示IL-1β主要来源于小胶质细胞。②对NLRP3炎症小体及NF-κB信号通路的影响。与对照组比,0.5mg/kgACR组黑质和纹状体中caspase-1荧光强度以及NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、caspase-1、P62、P-P65(Ser 536)、IκBα蛋白的表达均无明显改变(P>0.05);5mg/kgACR组黑质和纹状体中caspase-1荧光强度以及NLRP3、caspase-1、P62、P-P65(Ser 536)的表达均明显增加(P<0.05),IκBα显著降低(P<0.01),ASC和Pro-caspase-1表达无明显变化(P>0.05)。
  结论:大鼠长期暴露于5mg/kg/dayACR导致运动平衡功能减退,黑质和纹状体多巴胺能神经元损伤,小胶质细胞活化,NLRP3炎症小体和NF-κB通路激活以及炎症因子升高。0.5mg/kg/dayACR暴露导致黑质和纹状体神经元丢失,黑质小胶质细胞增生。
  第二部分神经炎症在丙烯酰胺致多巴胺能神经元损伤中的作用
  目的:选用炎症信号通路抑制剂进行干预,在体外研究神经炎症在ACR致多巴胺能神经元损伤中的作用,为防控ACR神经毒性提供新的方向。
  方法:分别以BV2细胞和经NGF诱导分化的PC12细胞作为小胶质细胞和多巴胺能神经细胞的体外模型。⑴ACR对BV2细胞的影响:0、0.6、1.25、2.5mMACR处理BV2细胞24h,收获细胞和培养液。⑵ACR通过BV2细胞条件培养基(Conditioned Medium, CM)介导PC12细胞毒性:设立0、0.6、1.25、2.5mMACR直接作用于PC12细胞组和0、0.6、1.25、2.5mMACR通过BV2条件培养基间接作用于PC12细胞组,作用时间24h。⑶炎症信号通路特异抑制剂的干预研究:5μMBay或10μMMCC950预处理BV2细胞2h,ACR再继续处理BV2细胞24h。0、2.5mMACR条件培养基与抑制剂预处理的0、2.5mMACR条件培养基分别作用于PC12细胞24h。CCK8检测细胞存活率,流式细胞术测凋亡,电化学发光(MSD)法检测炎症因子分泌,westernblot检测蛋白表达。
  结果:⑴ACR对BV2细胞的影响。①对细胞增殖和凋亡的影响。与对照组比,0.6mMACR明显促进细胞增殖(P<0.01),但对细胞凋亡无影响(P>0.05);1.25mMACR对细胞增殖和凋亡无影响(P>0.05),但能明显抑制Bcl-2的表达(P<0.001);2.5mMACR显著抑制细胞增殖(P<0.001),明显促进细胞早期凋亡和晚期凋亡(P<0.01),抑制Bcl-2的表达(P<0.001),促进Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved-caspase-3、CHOP的明显升高(P<0.01)。②对细胞内ROS含量的影响。与对照组比,0.6、1.25mMACR对ROS产生无明显影响(P>0.05);2.5mMACR暴露明显增加细胞内ROS含量(P<0.001)。③对细胞炎症因子分泌的影响。与对照组比,0.6mMACR明显促进促炎因子TNF-α分泌(P<0.001);1.25mMACR明显促进TNF-α分泌,显著抑制抑炎因子IL-4的分泌(P<0.01);2.5mMACR明显促进促炎因子IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-10的分泌(P<0.01),抑制抑炎因子IL-4的分泌(P<0.01)。④对NLRP3炎症小体和NF-κB通路的影响。与对照组比,0.6、1.25mMACR明显促进NLRP3表达(P<0.05);2.5mMACR激活NLRP3炎症小体,明显促进NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β的蛋白表达(P<0.05)。0.6、1.25mMACR不影响P65和IκBα表达(P>0.05);2.5mMACR能激活NF-κB通路,明显促进核内P65的表达(P<0.01),减少胞质P65和细胞IκBα的表达(P<0.01)。
  ⑵ACR通过BV2条件培养基介导PC12细胞毒性。①对PC12细胞增殖的影响。1.25、2.5mMACR通过BV2条件培养基抑制PC12细胞的增殖明显高于相应的直接作用组(P<0.001)。②对PC12细胞凋亡的影响。0.6mM、1.25mM、2.5mMACR通过BV2条件培养基诱发PC12细胞的早期凋亡率和Bax/Bcl-2比值均明显高于相应的直接作用组(P<0.001)。③对PC12细胞TH、P-TH(Ser40)的影响。ACR直接作用于PC12细胞,对TH、P-TH(Ser40)的蛋白表达均无明显影响(P>0.05)。ACR通过条件培养基作用于PC12细胞时,1.25mMACR能显著降低P-TH(Ser40)的蛋白表达水平(P<0.05);2.5mMACR明显抑制TH和P-TH(Ser40)的表达(P<0.001)。④对PC12细胞BDNF及突触蛋白的影响。0.6mM、1.25mMACR直接或通过BV2条件培养基对PC12细胞BDNF、SYN1、SYP的影响无明显差异(P>0.05);2.5mMACR通过BV2条件培养基对PC12细胞BDNF、SYN1、SYP的抑制明显高于相应直接作用组(P<0.05)。
  ⑶炎症信号通路特异抑制剂的干预研究结果。①抑制效果评价及对炎症因子分泌的影响。与对照组比,5μM的Bay11-7082(Bay)和10μM的MCC950Sodium(MCC950)预处理对BV2细胞存活率无明显影响(P>0.05)。与2.5mMACR比,Bay预处理能显著抑制核内P65的蛋白表达(P<0.001),MCC950预处理能明显抑制NLRP3蛋白表达(P<0.01);Bay预处理明显抑制BV2细胞IL-1β、IL-6、IFN-γ的分泌(P<0.001),MCC950预处理明显抑制IL-1β、IL-6、IL-10的分泌(P<0.001)。②抑制剂通过BV2条件培养基对PC12细胞增殖的影响。与2.5mMACR条件培养基比,Bay和MCC950预处理的2.5mMACR条件培养基对细胞增殖无明显影响(P>0.05)。③抑制剂通过BV2条件培养基对PC12细胞凋亡的影响。与2.5mMACR条件培养基比,Bay和MCC950预处理可以不同程度的抑制PC12细胞凋亡(P<0.001),MCC950预处理组Bax表达明显降低,Bcl-2蛋白表达明显升高,Bax/Bcl-2明显降低(P<0.001)。④抑制剂通过BV2条件培养基对PC12细胞TH、P-TH(Ser40)的影响。与2.5mMACR条件培养基比,Bay预处理对TH和P-TH(Ser40)的表达无明显影响(P>0.05),MCC950预处理能明显改善TH和P-TH(Ser40)的表达(P<0.01)。⑤抑制剂通过BV2条件培养基对PC12细胞BDNF及突触蛋白的影响。与2.5mMACR条件培养基比,Bay预处理明显促进BDNF表达(P<0.01),对SYN1、SYP蛋白的表达无影响(P>0.05),MCC950预处理明显促进BDNF、SYN1的表达(P<0.05),对SYP的表达无影响(P>0.05)。
  结论:ACR激活BV2细胞NLRP3炎症小体和NF-κB通路,促进BV2细胞炎症因子分泌,并介导ACR对多巴胺能神经元的损伤。
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